Passaging células-tronco neurais

Olá, sou Steve. Eu trabalho no laboratório do Dr. Flanagan no Departamento de Patologia da UC, Irvine. Hoje vou mostrar como dividir células precursoras neurais humanas.

Esta técnica envolve a codificação de um novo frasco com uma solução de fibronectina humana, levantando as células com tampão de dissociação celular e, em seguida, neutralizando o tampão de dissociação celular com uma solução de soro a 10%, centralizando a suspensão celular e resus suspendendo as células em fresco, meio e transferindo a suspensão celular para um novo frasco. Em nosso laboratório, cultivamos células precursoras neurais humanas trocando metade de seus meios a cada dois dias, e as passamos cerca de uma vez por semana, dividindo um a dois. Quando passo as células, posso contá-las se quiser trocá-las por um experimento de imunoquímica ou se quiser fazer uma transfecção com um efetor nuclear.

É importante usar um tampão de dissociação celular ao empacotar células porque, primeiro, não é enzimático, ao contrário da tripsina, e é muito mais suave para as células. Olá, estamos na sala de cultura de tecidos Agora, e antes de mostrar como é um frasco confluente de células precursoras humanas, primeiro vou preparar a cultura de tecidos. Primeiro, vou desligar a luz ultravioleta e ligar a luz e o fluxo de ar.

Em seguida, vou desinfetar o capô com etanol 70% borrifando uma toalha de papel e limpando o capô. É importante borrifar uma toalha de papel com 70% de etanol e não diretamente o interior do exaustor, porque borrifar o capô com 70% de etanol pode danificar o filtro HEPA, que é muito caro. Em seguida, vou pulverizar todos os reagentes e instrumentos.

E, finalmente, vou borrifar as mangueiras de vácuo e estamos prontos. Vamos dar uma olhada nessas células. Portanto, essas células parecem cerca de 80% confluentes.

Estas são células precursoras neurais humanas isoladas de fetos humanos e as cultivamos em frascos T 25. Nós os dividimos a cada semana, um a dois. Estou pronto para passar minhas celas agora.

E primeiro vou trazer um novo frasco T 25 que revesti por quatro horas com fibronectina humana da BD biosciences. Então eu removi a solução de fibronectina. Vou enxaguar este frasco com BBS antes de mover as células para o frasco.

E agora vou tirar as células da incubadora de 37 graus. Lá estão eles. Agora vou remover a solução de lavagem PBS do novo frasco que foi revestido com fibronectina humana.

E vou adicionar dois mililitros de mídia condicionada antiga no novo frasco. Então agora eu preciso enxaguar minhas células com PBS antes de poder tirá-lo da superfície. Então, primeiro, vou remover a mídia restante, adicionar cerca de dois mils de PBS imediatamente, sem molhar as células secas.

Vou esperar cerca de dois minutos antes de remover o PBS e colocar à venda o buffer de dissociação para tirar as vendas da superfície da crítica. Agora vou remover o PBS e, novamente, vou tentar adicionar um tampão de dissociação celular imediatamente para que as células não sequem. Então, vou adicionar 1,5 mils de tampão de dissociação celular.

E, ao contrário do PBS, vou adicioná-lo diretamente nas células e tentar cobrir o máximo de superfície possível. Então, estou movendo o frasco de um lado para o outro enquanto adiciono lentamente esse tampão às células. E vou esperar agora cerca de cinco minutos para que as células comecem a sair da superfície.

E vou deixar o frasco em temperatura ambiente no capô. Como você pode ver aqui, as células primeiro começam a se arredondar e depois começam a sair da superfície e você pode realmente ver algumas, algumas células já flutuando. E se você bater bem no frasco ao lado, isso vai ajudá-los a sair.

Então, já se passaram cinco minutos e, como você pode ver, a solução se tornou realmente densa com células que saíram da superfície. E agora vou neutralizar o efeito do tampão de dissociação celular adicionando 4,5 mils de soro contendo meio. Então, vou usar soro bovino fetal inativado a 10% de calor em meio D-M-E-M-F 12 e vou adicioná-lo diretamente na superfície do frasco para garantir que não haja células presas.

E eu vou, e vou pipetar suavemente para cima e para baixo para desalojar qualquer célula restante. E então vou transferir a solução celular para um tubo cônico de 15 mil. E eu vou girá-lo a mil RPM por um minuto.

Então, as células terminam de girar e temos aqui um lindo palete de células. Vou remover o meio de soro com muito, muito cuidado, sem tentar perturbar o palete. E então eu vou ressuspender o palete em quatro mils de, da mídia.

Então, vou tentar ressuspender o pellet para que não haja, haja, não haja mais aglomerados de células para que a solução se torne homogênea e contenha, não contenha aglomerados. E como estou fazendo uma divisão de um para dois, vou pegar dois dos quatro moinhos e transferi-los para o novo frasco que já contém dois mil da mídia de condição. E, finalmente, vou rotular o frasco com o tipo de célula, o número da passagem e a data.

Esta é uma olhada nas celas pelas quais passamos há meia hora. E como você pode ver, eles, a maioria deles, se prenderam à superfície e começaram a enviar processos. Isso é tudo, pessoal.

E agora estou pronto para contar.