Name: Passaging células-tronco neurais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a técnica de passagem de células-tronco neurais humanas (hNSPCs) in vitro usando fibronectina humana e tampão de dissociação celular. Este método melhora a reprodutibilidade em pesquisas com células-tronco neurais.

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Os autores agradecem o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional no Hospital da Criança, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de hNSPCs e instrução inicial em sua cultura.

Nota: Para cultura de rotina do nosso hNSPCs, mudamos 50-100% dos meios de comunicação todos os dias e, geralmente, a passagem deles 01:02 uma vez por semana. A cultura da mídia contém BIT-9500 20%, 1X fatores antibiótico / antimicótico e crescimento (EGF, FGF, PDGF e cada um com 40 ng / ml) em DMEM: F12 media base. Preparando o balão revestido e Dissociar as células <ol><li> Para preparar novos frascos para as células várias passagens, casaco T25 frascos com 10 mg / ml fibronectina humana no EMEM por 4 horas, ou durante a noite, em um 37 ° C a cultura de tecidos incubadora. Direito antes passaging as células, remova a solução fibronectina e enxaguar os frascos com PBS. </li><li> Transferir o velho &quot;condicionados&quot; media a partir de células a ser várias passagens para o novo fibronectina revestido balões (de tal forma que metade do volume final de mídia para cada frasco será o &quot;condicionada&quot; de mídia). Estas condições de cultivo ajudar a manter essas células em seu estado indiferenciado. </li><li> Depois de todos os meios de comunicação é removida das células para ser várias passagens, lavar as células uma vez com PBS. Tome cuidado para não secar as células. </li><li> Adicionar celular dissociação Buffer (CDB) diretamente sobre as células (1,0-1,5 ml para um frasco T25). Incubar as células no buffer por cerca de 5 minutos à temperatura ambiente. Batendo o frasco vai ajudar a acelerar o desprendimento de células. </li></ol> Centrifugação, ressuspensão e Células Plating <ol><li> Adicionar soro contendo media (DMEM: F12 com 10% inativado pelo calor soro fetal bovino) (use ~ o volume de 3X CDB) para o frasco com as células destacadas. Remova a mídia e as células para um tubo de 15 ml. Use um pequeno volume de soro fresco contendo mídia para lavar o balão e recuperar as células residual. </li><li> Centrifugar a mídia e as células a 1000 rpm (~ 200xg) por 5 minutos. </li><li> Sucção fora da mídia contendo soro e ressuspender as células em meio de cultura fresco, pipetando para cima e para baixo para fazer uma suspensão celular homogênea. </li><li> Transferência de metade das células ressuspenso em cada frasco novo para um split 1:2. Anote o número de nova passagem sobre o frasco. </li></ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell culture.</a> Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture.+Progenitor+cells+from+human+brain+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture. Progenitor cells from human brain after death.</a> Nature. 411, 42-43 (2001).</li>
<li>Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+neural+progenitor+cells+from+post-mortem+human+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex.</a> J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).</li>
</ol>

Descobrimos que este protocolo proporciona culturas confiável de hNSPCs. Um fator crítico para as nossas células é que elas precisam ser mantidas como culturas bastante densa e não pode ser várias passagens a tal ponto que as células são esparsas. Em nossas mãos, culturas esparsas crescem muito lentamente ou deixam completamente de se dividir. Por essa razão, costumamos dividir nossas culturas 1:2 ou 1:3 quando uma cultura é extremamente densa. Superfície do revestimento de uma placa de cultura com fibronectina é importante, pois promove a ...

<table><tbody><tr><td>BIT-9500 (BSA, Insulina, Transferrina)</td><td>Reagente</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12 (1X)</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>Reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>Distribuído pela Fisher sob o número de catálogo indicado</td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>FGF, recombinante básico humano</td><td>Reagente</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AB</td><td>Reagente</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>EGF, recombinante humano</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40052</td><td>Distribuído pela Fisher sob o número de catálogo indicado</td></tr><tr><td>Frasco para Cultivo Celular, 25 cm²</td><td>Ferramenta</td><td>Corning</td><td>10-126-28</td><td>Distribuído pela Fisher sob o número de catálogo indicado</td></tr><tr><td>Fibronectina, humana, natural</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40008A</td><td>Distribuído pela Fisher sob o número de catálogo indicado</td></tr><tr><td>Células-Tronco/Precursores Neurais Humanas</td><td>Células</td><td>Recurso Nacional de Células-Tronco Neurais Humanas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Dissociação Celular</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>13150-016</td><td></td></tr></tbody></table>

passaging células-tronco neurais

Passaging Human Neural Stem Cells

A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro fornece um meio para investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos, bem como para explorar muitos processos fundamentais do desenvolvimento neural humana e patologia. Este protocolo apresenta um método simples de cultura e hNSPCs passaging na esperança de padronizar esta técnica e aumentar a reprodutibilidade da pesquisa sobre células estaminais humanas. O hNSPCs usamos foram isolados a partir de cadáveres córtex cerebral pós-natal pela Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional e cresceu como adepto culturas em frascos revestidos com fibronectina (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Nós nossa cultura hNSPCs em DMEM: F12 sem soro meios suplementados com EGF, FGF, PDGF e passagem e eles 1:02 aproximadamente a cada sete dias. Utilizando essas condições, a maioria das células na cultura manter uma morfologia bipolar e expressam marcadores de células indiferenciadas as células-tronco neurais (como nestina e Sox2).

A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro permite investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos e para explorar o desenvolvimento neural humano. Este protocolo apresenta um método de cultivo e hNSPCs passaging na esperança de reprodutibilidade crescente de pesquisas sobre células estaminais humanas.

Passaging células-tronco neurais

A capacidade de manipular células-tronco/precursoras neurais humanas (hNSPCs) in vitro fornece um meio para investigar a sua utilidade como transplantes celulares para ...

Olá, eu sou o Steve. Trabalho no laboratório da Dra. Flanagan no Departamento de Patologia da uc, Irvine. Hoje vou mostrar como dividir células precursoras neurais humanas.Essa técnica envolve revestir um novo frasco com uma solução de fibronectina humana, destacar as células com tampão de dissociação celular, neutralizar o tampão de dissociação celular com uma solução de soro a 10%, centrifugar a suspensão celular e ressuspender as células em meio fresco, transferindo a suspensão celular para um novo frasco. Em nosso laboratório, cultivamos células precursoras neurais humanas trocando metade do meio a cada dois dias, e repassamos as células aproximadamente uma vez por semana, dividindo-as na proporção de um para dois. Quando repasso as células, posso contá-las se quiser utilizá-las em um experimento de imunoquímica, ou se pretender realizar uma transfeção com um efetor nuclear.É importante usar um tampão de dissociação celular ao manipular células porque, primeiro, ele é não enzimático, ao contrário da tripsina, e é muito mais suave para as células. Olá, estamos na sala de cultura de tecidos agora, e antes de mostrar a vocês como é um frasco confluente de células precursoras human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Introdução de um gene de interesse em uma célula é um método poderoso para elucidar a sua função in vivo. Este protocolo descreve um método eficiente de uma cultura de transfecting-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), utilizando o aparelho de eletroporação Nucleofector feita por Amaxa.

Transfecting células-tronco neurais com o Nucleofector Amaxa

Conhecimento do número exato de células viáveis ​​é necessário para muitos manipulações cultura de tecidos. Este protocolo descreve como diferenciar entre células vivas e mortas e quantificar as células usando um hemocitômetro. Embora contando descreve-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), ele pode ser usado para outros tipos celulares.

Contando células-tronco neurais

Células-tronco neurais foram preparadas a partir do hipocampo de adultos não-hibernando yearling esquilos do Ártico (AGS). Essas células-tronco neurais pode ser expandida através de numerosas passagens, diferenciados e mantidos como um neurônio quase 50:50 para a cultura da glia.

Crescimento e Diferenciação de Adultos Hippocampal terra ártico Squirrel células-tronco neurais

Um método simples e confiável sobre o isolamento e cultura de células-tronco neurais de tecido fetal humano descartado cortical é descrito. Derivados de culturas humanas conhecidas doenças neurológicas podem ser usados ​​para a caracterização de processos patológicos celular e molecular, bem como fornecer uma plataforma para avaliar a eficácia farmacológica.

Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

Pacientes com tumor cerebral rotineiramente submetidos à radioterapia cranial, e ao mesmo tempo benéfico, este tratamento muitas vezes resulta em disfunção cognitiva debilitante. Este grave problema por resolver tem no momento, nenhum recurso clínico, e tem impulsionado os nossos esforços para desenvolver terapias com células-tronco com base para a recuperação de induzida por radiação decrementa cognitiva.

Transplante de Células-tronco Estratégias para a Restauração da disfunção cognitiva causada pela radioterapia craniana

Este vídeo demonstra o método para diferenciar células-tronco neurais humanas de neuroesferas em progenitores neurais e astrócitos usando tratamento enzimático e cultura em um meio rico em fator de crescimento, o que eventualmente leva à maturação em células progenitoras especializadas.

Diferenciando células-tronco neurais humanas em progenitores neurais e astrócitos

Células-tronco neurais colhidas a partir do cérebro de adultos estão aumentando utilizado em aplicações que vão desde a pesquisa básica do desenvolvimento do sistema nervoso para explorar potenciais aplicações clínicas em medicina regenerativa. Isso faz com que o controle rigoroso das condições de isolamento e cultivo utilizados para cultivar essas células críticas a soar os resultados experimentais.

Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Este protocolo descreve um método de desbastamento mecânico novela que permite a expansão de células progenitoras e estaminais neurais agregados esféricos sem dissociação de uma única suspensão de células. Manter contato célula / célula permite um crescimento rápido e estável por mais de 40 passagens.

Um Método de Expansão cGMP-aplicável para Agregados de Neural Humano-tronco e células progenitoras derivadas de células-tronco pluripotentes ou tecido cerebral do feto

Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

Com a intenção de caracterizar mudanças em miRNAs em células-tronco neurais humanas diferenciadas (hNSCs), descrevemos a diferenciação de hNSC em um sistema tridimensional, a avaliação de mudanças na expressão de microRNAs por matriz de PCR de miRNA e análise computacional para predição de alvos de miRNAs e sua validação por ensaio de luciferase dupla.

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

A medula espinhal de mamíferos adultos contém células-tronco neurais/progenitoras (NSPCs) que podem ser isoladas e expandidas em cultura. Este protocolo descreve a coleta, isolamento, cultura e passagem de NSPCs geradas a partir da região periventricular da medula espinhal adulta do rato e de doadores de transplante de órgãos humanos.

Isolamento de Neural Stem / células progenitoras da Região Periventricular do rato adulto e Medula Espinhal Humano

Aprenda a técnica de passagem de células-tronco neurais humanas (hNSPCs) in vitro usando fibronectina humana e tampão de dissociação celular. Este método melhora a reprodutibilidade em pesquisas com células-tronco neurais.

Passaging células-tronco neurais

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