Modificado embrionárias de camundongos com células-tronco Ensaio baseado para quantificar a eficiência de indução cardiogênico

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar a regulação temporal crucial necessária para a diferenciação de cardiomiócitos em células-tronco embrionárias de camundongo. Isso é alcançado primeiramente pela formação de corpos embrionários em uma placa de fundo redondo com 96 poços, a fim de padronizar a formação de EBs como segundo passo. Moduladores proteicos ou químicos são adicionados aos EBs ao longo de um período de tempo predeterminado, o que permitirá o controle temporal das vias em estudo.

Em seguida, os EBS batendo são quantificados manualmente para determinar a eficiência de indução de diversos esquemas de modulação de sinal. São obtidos resultados que demonstram os requisitos temporais de vias de sinalização essenciais para a diferenciação de cardiomiócitos, com base na porcentagem de EBS batendo formados e na confirmação utilizando o método de gota suspensa. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como as gotas suspensas, é que ela padroniza e simplifica um procedimento que exige muito trabalho manual, permitindo uma leitura direta para quantificação.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da biologia de células-tronco, como identificar a coagulação sinalizadora essencial que orienta a diferenciação em direção ao tipo celular desejado. Para iniciar este procedimento, cultive células-tronco embrionárias de camundongo em placas de cultura celular de 10 centímetros com meio para células-tronco de camundongo suplementado com fator inibidor de leucemia. Quando as células-tronco estiverem com 50 a 70% de confluência, estarão prontas para uso.

Remova o meio ES e lave as células uma vez com cinco mililitros de PBS estéril. Adicione dois mililitros de tripsina 0,05% EDTA a cada placa e incube as placas a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Em seguida, interrompa a ação da tripsina com EDTA adicionando três mililitros de meio ES por placa e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros.

Centrifugue a 1000 rotações por minuto durante três minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular com a quantidade desejada de meio EB. Conte o número de células e, em seguida, dilua as células até cinco vezes 10 elevado a três células por mililitro.

No meio EB, utilizando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros de meio EB contendo células em cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços com fundo redondo. O número de placas de 96 poços necessário dependerá do número de condições e pontos temporais do experimento. Coloque as placas de microtitulação de 96 poços com fundo redondo em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para identificar janelas temporais críticas de vias de sinalização-chave para a cardiogênese.

Moduladores de vias de sinalização específicas são adicionados às células ES. Nas placas de 96 poços com fundo redondo, adicione o modulador de sinalização, que é diluído em meio, em cada poço em diversos pontos temporais. Metade dos poços em cada placa de 96 poços é utilizada para cada ponto temporal inicial do tratamento.

Um controle com veículo é adicionado às outras 48 cavidades para cada ponto temporal. Em diferentes momentos de interrupção, vamos remover os moduladores de sinalização de cada cavidade trocando o meio, e deve-se ter grande cuidado ao fazer isso para evitar perturbar os corpos embrionários em diferentes pontos temporais de interrupção. Remova os moduladores trocando o meio dos corpos embrionários nas cavidades. Incline a placa de 96 cavidades em aproximadamente 10 graus e remova suavemente o meio da cavidade com uma pipeta multicanal.

Em seguida, adicione novamente o meio EB sem modulador a cada poço para qualquer tratamento com duração superior a 48 horas. Troque o meio EB suplementado com moduladores frescos a cada dois dias até o tempo desejado de interrupção. Sete dias após a indução dos EBS, transfira as células ES para placas de 96 poços e examine a contração dos EBs sob um microscópio.

Marque os poços com EBS contráteis como positivos para obter as porcentagens de EBS contráteis para cada curso temporal de tratamento diferente. As janelas temporais de sinalização para a cardiogênese identificadas nos experimentos com placas de 96 poços podem ser verificadas em EBS produzidos a partir de gotas suspensas, para formar gotas de EB pendulares. Primeiro, prepare as placas de Petri adicionando três a quatro mililitros de PBS para prevenir posterior desvio das gotas.

Em seguida, uma suspensão de células ES preparada com densidade final de 2,5 × 10⁴ células por mililitro é despejada em uma placa bacteriológica para fácil acesso. Usando uma pipeta multicanal, adicione gotas de 20 µL de células ES sobre as tampas invertidas das placas de Petri. Não permita que as gotas individuais entrem em contato umas com as outras.

Normalmente, uma tampa pode acomodar até 80 gotas. Em seguida, vire a tampa novamente sobre a placa de Petri contendo PBS e incube por 48 horas em um incubador com 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir a formação de EBs. Após 48 horas, lave os EBs formados a partir das gotas suspensas de cada tampa com três mililitros de meio para EB.

Puxe duas tampas de EBS para um novo recipiente de Petri. Incube o recipiente de Petri por quatro dias em uma estufa com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. No quarto dia, transfira os EBS em suspensão para placas de seis poços revestidas com gelatina 0,2%, em geral. Trinta EBS são transferidos para cada poço, incubando com moduladores de sinalização no período determinado a partir dos experimentos em placa de 96 poços, sete dias após a formação das gotas suspensas.

Observe o EBS ao microscópio para verificar a contração dos EBs. Células ES cultivadas nos poços de fundo redondo de uma placa de 96 poços formarão EBS, conforme mostrado nesta imagem representativa de um EB formado no quarto dia. Os pontos temporais críticos para a cardiogênese de ES são as janelas temporais que contêm a maior porcentagem de EBS contráteis tratados com moduladores de sinalização, quando comparados ao controle com veículo. Aqui é mostrado um foco espontaneamente contrátil de cardiomiócitos formado a partir de células ES tratadas com morfina dorsal no décimo dia de diferenciação em uma placa de microtitulação de 96 poços.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar de forma eficiente a regulação temporal crítica e as janelas de sinalização chave nas vias de sinalização durante a cardio gênese em células-tronco embrionárias.