Modificado embrionárias de camundongos com células-tronco Ensaio baseado para quantificar a eficiência de indução cardiogênico

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar a regulação temporal crucial necessária para a diferenciação de cardiomiócitos em células-tronco embrionárias de camundongos. Isso é conseguido primeiro formando corpos embrionários em uma placa inferior redonda de 96 poços para padronizar a formação de EB como uma segunda etapa. Moduladores proteicos ou químicos são adicionados ao EBS ao longo de um curso de tempo predeterminado, o que permitirá o controle temporal das vias em exame.

Em seguida, o EBS de batimento é quantificado manualmente para determinar a eficiência de indução de vários esquemas de modulação de sinal. São obtidos resultados que mostram os requisitos temporais das vias de sinalização essenciais para a diferenciação de cardiomiócitos com base na porcentagem de EBS de batimento formada e confirmação usando o método de gota suspensa. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como gotas suspensas, é que ela padroniza e simplifica um procedimento trabalhoso e permite uma leitura direta para quantificação.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia de células-tronco, como identificar a coagulação de sinalização essencial que direciona a diferenciação para o tipo de célula desejado Para iniciar este procedimento. Células-tronco embrionárias de camundongos Gro em placas de cultura de células de 10 centímetros com meio de células ES de camundongo suplementado com fator inibidor de leucemia. Quando as células ES estão em 50 a 70% de confluência, elas estão prontas para uso.

Remova o meio ES e enxágue as células uma vez com cinco mililitros de PBS estéril. Adicione dois mililitros de 0,05% de tripsin EDTA a cada placa e incube as placas a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Em seguida, tempere os disparos em EDTA com três mililitros de meio ES por placa e transfira as células para um tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Gire a 1000 rotações por minuto por três minutos. Após a centrifugação, remova o supinato e ressuspenda o pellet celular com a quantidade desejada de meio EB. Conte o número de células e dilua as células para cinco vezes 10 elevado a três células por mililitro.

Em meio EB usando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros de meio EB contendo células em cada poço de uma placa microtituladora de 96 poços redondos de fundo. O número de placas de 96 poços necessárias dependerá do número de condições e pontos de tempo do experimento. Coloque as 96 placas de microtitulação de fundo redondo em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a 5% para identificar janelas de tempo críticas das principais vias de sinalização para a cardiogênese.

Moduladores de vias de sinalização específicas são adicionados às células ES. Nas 96 placas de poço de fundo redondo, adicione o modulador de sinalização, que é diluído em meio em cada poço em vários pontos de tempo. Metade dos poços em cada placa de 96 poços é usada para cada ponto de início do tratamento.

Um controle de veículo é adicionado aos outros 48 poços para cada ponto de tempo Em diferentes pontos de parada, vamos lavar os moduladores de sinalização de cada poço alterando o meio e muito cuidado deve ser tomado ao fazer isso para evitar a interrupção dos corpos embrionários em diferentes pontos de tempo de parada. Lave os moduladores trocando o meio EB dos poços. Incline a placa de 96 poços em um ângulo de cerca de 10 graus e remova suavemente o meio do poço com uma pipeta multicanal.

Em seguida, adicione de volta o meio EB sem modulador a cada poço para qualquer tratamento por mais de 48 horas. Troque o meio EB complementado com moduladores novos a cada dois dias até o tempo de parada desejado. Pontos sete dias após a EBS foram induzidos pela transferência de células ES para placas de 96 poços examinam a contração da EB ao microscópio.

Marque os poços com EBS de contração como positivos para obter porcentagens de EBS de contração para cada ciclo de tempo de tratamento diferente. As janelas de tempo de sinalização para cardiogênese identificadas pelos experimentos de 96 placas de poços podem ser verificadas em EBS feitas de gotículas penduradas para fazer gotículas de EB penduradas. Primeiro prepare placas de Petri adicionando três a quatro mililitros de PBS para aberração preventiva das gotículas mais tarde.

Em seguida, uma suspensão de células ES preparada em uma densidade final de 2,5 vezes 10 elevado a quatro células por mililitro é despejada em um prato bacteriano para facilitar o acesso. Usando uma pipeta multicanal, adicione gotas de 20 microlitros de células ES nas tampas invertidas das placas de Petri. Não permita que as gotículas individuais se toquem.

Geralmente, uma tampa pode acomodar até 80 gotas. Em seguida, vire a tampa de volta sobre a placa de Petri contendo PBS incubar por 48 horas em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a 5% para permitir a formação de EB. Após 48 horas, lave o EBS formado a partir de gotículas penduradas de cada tampa com três mililitros de meio EB.

Puxe duas tampas de EBS para uma nova placa de Petri. Incube a placa de Petri por quatro dias em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a 5% no quarto dia, transfira o EBS em suspensão para placas de seis poços revestidas com gelatina a 0,2% em geral. 30 EBS são transferidos para cada modulador de sinalização de incubação de poço no período de tempo identificado a partir dos experimentos de 96 placas de poços sete dias após a produção das gotículas suspensas.

Observe o EBS ao microscópio para contração de EB As células ES cultivadas nos poços redondos de fundo de uma placa de 96 poços formarão EBS, conforme mostrado nesta imagem representativa de um EB formado no quarto dia. Os pontos críticos de tempo para a cardiogênese do ES são as janelas de tempo que contêm a maior porcentagem de contração de EBS tratada por moduladores de sinalização quando comparados ao controle do veículo. Aqui é mostrado um foco de contração espontânea de cardiomiócitos formados a partir de células ES tratadas com morfina dorsal no dia 10 de diferenciação em uma placa de microtitulação de 96 poços.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar com eficiência a regulação temporal crítica, janelas das principais vias de sinalização na cardiogênese do ES.