Name: PGS elastomérico Andaimes em Engenharia de Tecidos Arterial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-08T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a fabricar andaimes tubulares porosos de elastômeros biodegradáveis para engenharia de tecidos arteriais. Este método utiliza células musculares lisas vasculares em bioreator de fluxo pulsátil para produzir matriz extracelular nativa.

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O autor agradece a Dr. Jin Gao para PGS síntese, o Dr. Peter Crapo para perspicaz discussão para biorreator de instalação, os drs. Mohamed Ezzelarab e Wei Wu para explanting artérias carótidas babuíno. Este estudo foi suportado por uma concessão do National Institutes of Health (R01 HL089658).

1. Andaime Tubular Fabricação <ol><li> Prepare tubos de vidro (comprimento = 70 mm, diâmetro externo = 9,0 mm, espessura da parede = 1,0 mm; peças pequenas, Miramar, FL) como um molde para andaime. </li><li> Prepare 1,0 wt / vol% ácido hialurônico (AH) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) pela dissolução de 100 mg de HA em 10 ml de água deionizada. Misture usando um rotator durante a noite até que não haja bolhas de ar na solução. </li><li> Despeje solução de HA de 1,0% no topo do tubo de vidro. Deixe-a fluir lentamente ao longo da parede interna do molde. Vire o tubo quando a solução atingiu o fundo do molde usando o rotator e repita este passo até que a parede interna do molde é revestido uniformemente pela solução. </li><li> Após o revestimento, seque todas as tubulações de vidro no forno a vácuo a 37 ° C por 24 h. </li><li> Moer e partículas de sal peneira (size = 25-32 mm) usado como porogens. </li><li> Montar um tubo de vidro (interior revestido com 1,0% HA solução), mandril (aço inoxidável revestido por tubo de PTFE), calor shrinkable luva (HS), e PTFE anel, conforme descrito anteriormente 8. </li><li> Adicionar partículas de sal do tamanho desejado para o molde de vidro com uma espátula através do funil de borracha de silicone. Toque o molde com cuidado para assegurar uma distribuição uniforme de partículas de sal. Raspe as partículas excesso de sal na parte superior do molde usando o lado da espátula. </li><li> Ligue a hibridização incubadora por 30 minutos antes de transferir o molde de sal embalado. Desligue a hibridização incubadora e Coloque o sal-embalados molde para a hibridização incubadora para a fusão de sal. </li><li> Remove os moldes da hibridação incubadora e seque-as no forno a vácuo a 37 ° C por 24 h. </li><li> Remove os moldes de sal-embalados do forno a vácuo e deixe esfriar em temperatura ambiente. Remova o mandril de aço inoxidável, empurrando-a para baixo com segurando o anel PTFE. Se o mandril é demasiado apertado para o molde, use o alicate para puxá-lo para fora. Remova o anel de PTFE a partir do fundo do molde. </li><li> Coloque os moldes no forno a 120 ° C por 5 min para termoencolhíveis HS. Verificar se a luva HS é encolhido. Remova a luva HS a partir dos moldes de sal embalado e deixe esfriar em temperatura ambiente. Manter os moldes para o exsicador até que eles são usados. </li><li> Prepare a solução PGS dissolvendo 3 g de PGS em 15 ml de tetraidrofurano (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para formar um wt 20 / vol solução%. </li><li> Adicionar a solução PGS para o lúmen de sal-embalados moldes, largando-o usando um spoid na capa hume. Magra o molde de vidro cerca de 45 ° e soltar a solução PGS em lúmen interno com rotação do molde lentamente. Verifique se a solução PGS flui para baixo ao longo da parede do molde. Se lugar seco é observado, adicione mais solução. </li><li> Após a adição da solução PGS, coloque os moldes no bairro hume por pelo menos 30 min para a evaporação THF. </li><li> Coloque os moldes no forno a vácuo para pré-determinado o tempo de cura (ex. 24/36 / 48 h) a 100 mTorr e 150 ° C para a PGS cura. </li><li> Após a cura, tire os moldes e colocá-los em temperatura ambiente para esfriar. Dip cada molde para a água deionizada com posição vertical lentamente. Não mergulhe-os na água rapidamente, porque as bolhas de ar podem causar desgaste ao cadafalso. </li><li> Transferir os moldes para o banho de água com cuidado e coloque-os em um ângulo de 1 h usando tubo de silicone para dissolver HA facilmente. Verifique se HA é dissolvido a partir do molde. Se não HA é liberado a partir do molde, empurre a uma extremidade do andaime lentamente usando a espátula para soltá-la do molde. Repita este passo na outra extremidade do andaime e agitar o molde e para trás lentamente em banho-maria. Verifique se o andaime é movido dentro do molde. </li><li> Transferir o andaime para outro banho-maria com agitador com cuidado. Não pegue o andaime firme, o que pode rachar o cadafalso. Coloque o andaime no banho de água por pelo menos três dias com a mudança de água para lixiviar as partículas de sal. </li><li> Depois de lixiviação de partículas de sal, a transferência de cada cadafalso para o tubo de centrifugação de 15 ml preenchido com a água deionizada e coloque-os na caixa de gelo seco por 1 h para congelar. Colocar tubos de centrífuga para o liofilizador (todos os táxis do tubo devem ser abertas) e lyophilize-los durante 2 dias. </li><li> Coloque todos os andaimes para o dessecador antes até que elas são usadas. </li></ol> 2. Preparação para o cadafalso Seeding celular <ol><li> Retire andaimes do exsicador e cortá-los até 25-30mm de comprimento. </li><li> Prepare duas rolhas de borracha de silicone (diâmetro = 20 mm, espessura da parede = 6,35 mm, diâmetro do furo do meio = 3 mm) e conectar dois tubos de PTFE (diâmetro externo = 3,97 milímetros, diâmetro interno = 2,38 milímetros, espessura da parede = 0,79 mm, comprimento = 60 mm e 40 mm) através dos furos meio de cada rolha. </li><li> Corte um anel como um HS 1.5 mm de comprimento e colocá-lo em cima de uma das extremidades do andaime. Empurrar um tubo de PTFE (ligado rolha de borracha de silicone) em uma extremidade de andaime como parte sobreposição menor possível. </li><li> Coloque o tubo de andaime e PTFE para o forno a 120 ° C por 10 min a encolher anel HS. Verifique se o anel de HS é encolhido e andaimes são conectados a tubagem de PTFE com firmeza. </li><li> Retire o tubo de andaime e PTFE e colocá-los em temperatura ambiente para esfriar. Coloque o conjunto tubo de andaime-PTFE para dentro do tubo de policarbonato (diâmetro externo = 15,5 mm, diâmetro interno = 9 mm, comprimento = 50 mm) como uma câmara de biorreator. </li><li> Conectar outro final de tubagem de PTFE para o cadafalso como passos 2.3) e 2.4). </li><li> Ajustar duas rolhas de borracha de silicone para fixar suas superfícies internas de ambas as extremidades do tubo de policarbonato. Prenda as duas superfícies externas de rolhas de borracha de silicone para duas placas de liga de alumínio (superior e inferior; width = 20 mm, comprimento = 70 mm, espessura = 6,35 mm). Coloque duas varas enfiadas no buraco do lado da placa e fixar o tubo de policarbonato (incluído o interior andaime) para placas apertando o parafuso porca polegar no prato. </li><li> Medir o comprimento de cada seedable andaime (comprimento entre dois anéis HS) e calcular a área da superfície interna (π x comprimento x diâmetro interior seedable) de cada andaime para a semeadura de células. </li><li> Enrole uma unidade de câmara de biorreator com papel alumínio e esterilizar em autoclave a 120 ° C por 30 min. Esterilizar cada parte (reservatório de meio, a tubulação da bomba, trocador de gás, manifolds, e válvula de agulha) do biorreator em autoclave a 120 ° C por 30 min e montá-los dentro do capô de cultura de células. </li><li> Pré-tratamento e enxaguar andaimes com uma série de perfusões (70, 50 e 25% de etanol para 1 h, tampão fosfato (PBS; Mediatech, Herndon, VA) por 2 h, e meio de cultura SMC por 24 h, utilizando uma bomba peristáltica em 1,0 ml / min no circuito de fluxo. </li></ol> 3. Seeding celular e Cultura <ol><li> Isolar arterial primária células musculares lisas (PMEs) das artérias carótidas de juvenis de babuínos machos (Papio anubis) e caracterizá-los em duas dimensões da cultura (2D) antes passaging e semeadura, como descrito anteriormente 9. </li><li> Expandir SMCs usando o MCDB 131 médio (Mediatech, Herndon, VA) com 10% de soro fetal bovino (Lonza, Walkersville, MD), 1% de L-glutamina (Mediatech), 50 mcg / ml de ácido ascórbico (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), e uma solução antibiótica-antimicótica (10.000 UI / ml de penicilina, 10.000 mg / ml, estreptomicina e 25 mg / ml anfotericina B; Mediatech). </li><li> Retire cada câmara biorreator do circuito de fluxo no biorreator. SMCs semente (passagem 4-6) para o cadafalso com uma densidade de 2x10 6 células / cm 2 através da injeção de suspensão com 5 ml no lúmen de andaimes, após cortar os abluminal (entrada) e luminal (saída) os fluxos. </li><li> Coloque todas as câmaras de biorreatores para a hibridização incubadora a 37 ° C e gire-a 2 rpm por 4 h para permitir que as células a se espalhar uniformemente no cadafalso. </li><li> Retire câmaras biorreator da hibridação incubadora anexá-los ao fluxo de circuito do biorreator na capa. Transferência de todo o sistema de cultura de células em biorreatores incubadora. </li><li> Conecte a tubulação da bomba (diâmetro interno = 1,6 mm) para a cartilagem da bomba peristáltica e carregar meio de cultura novo no reservatório. Iniciar a perfusão através de parede (luminal para abluminal) em 1,0 ml / min para 15 min seguido de fluxo luminal só. </li><li> Aumentar a taxa de fluxo e pressão gradualmente a partir de 1,0 ml / min (estresse de cisalhamento luminal: 1.1 dinas / cm 2) e 20 mmHg no dia 1-14,2 ml / min (15,3 dinas / cm 2) e 120 mmHg no dia 21, respectivamente. Alterar a tubulação da bomba (diâmetro interno = 3,2 mm) no dia 4 e meio uma vez por semana. </li></ol> 4. A colheita de tecidos e Preparação de Amostras para Análise <ol><li> Após o cultivo de 21 dias, parar a bomba e tubulações braçadeira (entrada e saída) do reservatório de médio porte. Separar a tubulação da bomba a partir da cartilagem da bomba peristáltica e um sistema de biorreator transferência para o capô. </li><li> Braçadeira de entrada e tubulações de saída de cada câmara de reactores biológicos e retirá-la da alça fluxo. Abra o tubo de admissão e preparar um prato de petri-na tubulação de saída para coletar meio de cultura no interior do tubo de policarbonato. Abrir a tubulação de saída de forma lenta e remova a mídia da câmara. </li><li> Separar agulha abluminal e tubos de silicone luminal da câmara e retire placas de alumínio, liberando parafusos. Retire o tubo de policarbonato e retire uma das extremidades do tecido construção da tubulação de PTFE. </li><li> Prepare um prato de petri preenchida com 10 ml de PBS e retire outro lado da construção da tubulação de PTFE. Coloque construir no PBS e lavar três vezes. </li><li> Corte a construir com uma lâmina de barbear como 5 mm de comprimento. Congelar a -80 ° C para o congelador bioquímica ou transferi-lo para 15 tubo de centrifugação ml preenchida com 5 ml de meio fresco para testes mecânicos ou congelar encaixem no composto temperatura Tissue-Tek ideal de corte (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA ) para histologia / immunoflucoloração orescence. </li></ol> 5. Resultados representativos: Os andaimes tubular PGS foram confeccionadas em elastômeros biodegradáveis ​​pelo método de sal de fusão (Fig. 1A). Cada câmara biorreator desde andaimes com os fluxos tanto luminal e abluminal e poderia ser destacado como uma unidade separada de um loop de fluxo principal (Figura 1B). Biorreator sistema foi projetado para cultura quatro andaimes de uma vez por meio do controle e monitoramento de fluxo, bem como a pressão (Fig. 1C e D). Esquemática da cultura biorreator foi mostrado na figura. 2. Após a semeadura SMCs, cada câmara biorreator foi rodado a 37 ° C por 4 h para distribuir uniformemente as células no lúmen do andaime. E, em seguida, o fluxo pulsátil foi aplicado para andaimes até o dia 14 com taxa de fluxo aumentando gradualmente (Fig. 2A) e pressão (Fig. 2B). Após o dia 14, o fluxo ea pressão mantida constante até o final da cultura (dia 21). Morfologia da superfície do andaime PGS foi examinada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Microscopia eletrônica de varredura mostrou que andaime tinha parede consistente espessuras (539 ± 18 mm) (Fig. 3A) e distribuídos aleatoriamente macro e micro-poros na superfície luminal (Fig. 3B). Parâmetros morfométricos do andaime foi medido a partir microcomputed tomografia (micro-CT) e análise de imagem. Tamanho dos poros média é de 23,3 ± 3,9 mm e interconectividade dos poros é 99,4 ± 0,62%, o que significa que todos os poros estão totalmente interligados em andaime. Porosidade medidos pelo deslocamento de etanol é de 75,6 ± 2,7%. Morfologia celular da construção PGS foi examinado por MEV (Fig. 4). SMCs multicamadas completamente coberto a superfície luminal e eles foram orientados perpendicularmente ao sentido do fluxo. Estes resultados mostram que o condicionamento mecânico de biorreator fluxo pulsátil suporta orientação SMC no cadafalso. A presença de matriz extracelular (ECM) e fibras elásticas foram examinadas por H &amp; E e coloração autofluorescência elastina (Fig. 5). Coloração H &amp; E demonstraram que as células e proteínas ECM completamente coberto do lúmen do PGS construir. Elastina autofluorescência também mostrou organizadas circunferencialmente fibras elásticas na superfície luminal do construto. Produção de proteínas ECM em construções PGS foram medidos a partir ensaios bioquímicos. A elastina e conteúdo de colágeno insolúvel foram 20,2 ± 9,1 mg / mg de tecido e de 6,3 ± 1,9 mg / mg de tecido, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Scaffold fabricação e sistema de biorreatores. (A) Esquema de andaime tubular de fabricação. (B) da câmara biorreator. Andaimes foram conectados a tubagem de PTFE, colocadas dentro do tubo de policarbonato, e fixado por rolhas de borracha de silicone e placas de liga de alumínio. Cada câmara tem dois caminhos de fluxo: fluxo luminal (por tubo de silicone) e abluminal (por agulha). (C) sistema de biorreator colocado dentro da incubadora. Inclui reservatório de meio, módulo de bomba peristáltica, trocador de gás, transdutores de pressão, dois manifolds (superior e inferior), e válvula de agulha. (D) sistema de biorreator colocado fora da incubadora. Ele inclui monitor de pressão, unidade de controle de fluxo, dados do sistema, aquisição e computador. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esquemática da cultura biorreator. (A) protocolo de Cultura. (B) Aplicada perfis de pressão em cada ponto do tempo (dia 1, 4, 7 e 14). <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Morfologia da superfície do andaime PGS. (A) Corte transversal. (B) Lumen. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Morfologia celular da PGS construir. (A) Lumen. (B) Seção transversal de corte 45 °. Setas em ambos os números representam a direção do fluxo. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Histologia e elastina autofluorescência do PGS construir. (A) coloração H &amp; E. (B) autofluorescência elastina correspondentes. L: lúmen. Ampliação: 40X. Barra de escala: 50 mm.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A técnica de fabricação utilizando um elastômero biodegradável descrito aqui tem várias características. (1) Foi utilizado ácido hialurônico (HA) como uma desmoldagem. Desde HA é solúvel em água, andaime foi facilmente liberado do molde de vidro após imersão em água. Neste relatório, foram utilizados 1,0% wt / vol de solução de HA, porque baixa concentração (&lt;0,5% wt / vol) de solução não é viscoso e flui tão rápido quando coloca-lo em cima do tubo de vidro. Para solução de HA revestimento uniforme, que virou o tubo de vidro quando a solução voou baixo na parte inferior do tubo e repetiu esta etapa. Este revestimento HA é uma crítica ao nosso procedimento de fabricação para liberar andaimes final. (2) Usamos calor shrinkable luva (HS) para a retenção de sais no tubo de vidro. Desde sais foram densamente no espaço entre a parede interna do tubo de vidro ea luva HS, manga HS sais retidos após a remoção do mandril eo anel de PTFE no fundo da tubulação. Poderíamos remover manga HS facilmente colocando o molde em um forno a 120 ° C por 5 min, e então obter modelos sal tubular. (3) Foi utilizado o método de fusão de sal. É sabido que o método de fusão de sal pode aumentar a interconectividade dos poros e propriedades mecânicas, variando o tempo de fusão 10. Além disso, como usamos PGS, macro-poros foram produzidas pelas partículas de sal durante o processo de lixiviação, enquanto a micro-poros foram provavelmente gerado por vapor glicerol formado durante PGS cura como descrito anteriormente 11. Assim, este método tem um potencial para fabricar andaimes tubular poroso com macro e micro-estruturas diferentes, variando partículas de sal, bem como PGS cura condição. O condicionamento mecânico do biorreator forneceu fluxo de perfusão pulsátil (média máxima de fluxo = 14 ml / min, tensão de cisalhamento máxima = 15,3 dina / cm 2, freqüência = 0,5-1,7 Hz) e fisiologicamente pressão relevante com o andaime PGS, o que levou a SMC crescimento e orientação (Fig. 4). Estes resultados são consistentes com estudos anteriores relatórios que se estendem cíclico nessa freqüência e tensão de cisalhamento aumenta a proliferação SMC 12, e ECM produção de proteína 13,14. Além de SMC crescimento e orientação, PGS construir apoiado ECM produção de proteína, especialmente circunferencialmente organizado fibras elásticas (Fig. 5) dentro de 3 semanas de cultura no biorreator. Alguns estudos usando um andaime elastomérica como uma construção de pequeno diâmetro arterial têm demonstrado resistência mecânica e pressão de ruptura comparável ao artérias nativas 15, SMC e integração rápida em andaimes compatível usando giratório frasco 16,17, enquanto as fibras elásticas não foram encontrados nessas construções. Nossos resultados sugerem que a distensão cíclica radial do biorreator melhorou a transdução do sinal mecânico mais eficaz para PMEs no PGS andaime, o que provavelmente contribuiu para a síntese de elastina e organização. Desde SMCs vasculares foram as únicas células que produzem proteínas ECM na nossa abordagem endotélio, repouso e melhorar a resistência mecânica são necessários para desenvolver uma clínica de sucesso pequeno diâmetro constrói arterial. Temos relatado que as células endoteliais co-cultivados com SMCs gerado uma monocamada confluente e expressão da proteína apoiado fenótipo em condições de nossa cultura e condicionamento mecânica 9. Portanto, com base em nossa abordagem descrita aqui, modificação das condições de co-cultura experimento seria um próximo passo para melhorar as funções de construções resultantes e gerar não-trombogênica, robusto e compatível arterial construção semelhante às artérias nativas.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Sal sódico do ácido hialurônico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H7630 </td></tr><tr><td> Tetrahidrofurano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td></tr><tr><td> MCDB 131 </td><td> Mediatech </td><td> 15-100-CV </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Lonza </td><td> BW14-502F </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-CV </td></tr><tr><td> Ácido ascórbico </td><td> Fisher Scientific </td><td> A62-500 </td></tr><tr><td> Antibiótico antimicótico solução </td><td> Mediatech </td><td> 30-004-CI </td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino (PBS) </td><td> Mediatech </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Tissue Tek compostos temperatura ideal de corte, 4583 </td><td> Sakura Finetek </td><td> 25608-930 </td></tr></tbody></table>

pgs elastomérico andaimes em engenharia de tecidos arterial

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Doença cardiovascular é uma das principais causas de mortalidade em os EUA e, especialmente, a doença arterial coronariana aumenta com o envelhecimento da população e aumento da obesidade 1. Atualmente, a cirurgia de bypass utilizando navios autólogos, enxertos e enxertos sintéticos são conhecidos como comumente usado para substitutos arterial 2. No entanto, esses enxertos tem aplicações limitadas quando um diâmetro interno das artérias é menos de 6 mm, devido à baixa disponibilidade, complicações trombóticas, incompatibilidade de conformidade, e hiperplasia intimal final 3,4. Para superar essas limitações, a engenharia de tecidos tem sido aplicado com sucesso como uma alternativa promissora para desenvolver construções de pequeno diâmetro arterial, que são não-trombogênica, robusto, e compatível. Vários estudos anteriores desenvolveram construções de pequeno diâmetro arterial com tri-estrutura lamelar, excelentes propriedades mecânicas e pressão de ruptura comparável ao artérias nativas 5,6. Enquanto elevada resistência à tração e pressão de ruptura de colágeno, aumentando a produção de um material rígido ou camada de células andaime, essas construções ainda tinham a produção de elastina baixa e de conformidade, que é um problema grave para causar a falência do enxerto após o implante. Considerando essas questões, a hipótese de que um biomaterial elastometric combinado com o condicionamento mecânico daria elasticidade e conduzir sinais mecânicos de forma mais eficiente de células vasculares, que aumentam a produção de matriz extracelular e apoio de orientação celular. O objetivo deste relatório é apresentar uma técnica de fabricação de materiais porosos andaimes tubulares e um condicionamento dinâmico mecânica de aplicação para a engenharia de tecidos arterial. Usamos um elastômero biodegradável, poli (sebacato glicerol) (PGS) 7 para a fabricação de andaimes tubular poroso a partir do método de fusão de sal. Adulto primário babuíno células musculares lisas (PMEs) foram semeadas na luz de andaimes, que cultivadas em nosso biorreator de fluxo pulsátil projetado para 3 semanas. PGS andaimes tinham uma espessura consistente e distribuídos aleatoriamente macro e micro-poros. Condicionamento mecânico de biorreator fluxo pulsátil apoiado SMC orientação e maior produção de ECM em andaimes. Estes resultados sugerem que andaimes elastomérico e condicionamento mecânica da cultura biorreator pode ser um método promissor para a engenharia de tecidos arterial.

Andaimes elastomérico PGS com células musculares lisas vasculares cultivadas em biorreator fluxo pulsátil pode levar a promissora construções de pequeno diâmetro arterial com a produção de ECM nativas em um período relativamente curto cultura.

PGS elastomérico Andaimes em Engenharia de Tecidos Arterial

As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de mortalidade nos EUA e, especialmente, a doença arterial coronariana aumenta com o envelhecimento da população e...

Este vídeo mostra como fabricar scaffolds tubulares porosos e submetê-los a um condicionamento mecânico dinâmico para engenharia de tecidos arteriais. Isso é realizado primeiramente fabricando os scaffolds utilizando um elastômero biodegradável e o método de fusão por assalto. Os scaffolds são então preparados para o semeadura celular e montados em um sistema de biorreator.No biorreator, células musculares lisas vasculares semeiam os escafóldos e são cultivadas. Semanas depois, o tecido é colhido e analisado por meio de microscopia eletrônica de varredura, coloração h e e e autofluorescência de elastina. O músculo liso resultante é tanto multicamadas quanto orientado perpendicularmente.A principal vantagem desta técnica, semelhante à lixiviação de partículas, é utilizar o molde de vidro para fabricar uma estrutura tubular porosa com ácido hialurônico. Ao remover o molde, a estrutura é preparada a partir de um pedaço de tubo de vidro. Coloque o tubo em um suporte e despeje a solução de ácido hialurônico preparada no dia anterior dentro do tubo.O ácido hialurônico flui lentamente ao longo da parede interna. Quando atingir a base do molde, vire o molde ao contrário. Repita este passo até que a parede interna do molde seja uniformemente revestida pela solução.Após o revestimento, seque todas as formas de vidro preparadas em estufa a vácuo a 37 graus Celsius por 24 horas. Normalmente, quatro formas são preparadas simultaneamente enquanto as formas de vidro secam. Prepare os vertimentos de partículas de sal, moa e SVE as partículas de sal para 25 a 32 micrômetros.No dia seguinte, monte o mandril de molde de vidro preparado, o tubo de PTFE, a manga termorretrátil e o anel de PTFE. Primeiro, insira o mandril em segmentos de 65 milímetros de comprimento de tubo de PTFE e aqueça-os a 120 graus Celsius por cinco minutos. Enquanto espera que o PTFE encolha, pré-aqueça um incubador de hibridização a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos.Uma vez que o tubo tenha envolvido completamente os mandris, empurre a manga termorretrátil para o mandril de modo que ela se mova livremente. Em seguida, coloque o mandril dentro do molde de vidro e fixe o anel de A-P-T-F-E na extremidade inferior do mandril. Verifique se o anel de PTFE está bem ajustado à base do molde de vidro.Em seguida, utilizando uma espátula e um funil de borracha de silicone, adicione mingaus de partículas de sal ao molde de vidro. Em seguida, bata levemente o molde com a espátula para obter uma distribuição uniforme das partículas e remova o excesso de sal. Agora desligue o incubador aquecido e carregue-o rapidamente com os moldes cheios de sal; o sal fundirá ao longo dos próximos 30 minutos, após o que seque os moldes em uma estufa a vácuo a 37 graus Celsius por 24 horas.No dia seguinte após o resfriamento, remova o mandril de aço inoxidável dos moldes empurrando-o para fora enquanto segura o anel de PTFE. Se necessário, use alicate de ponta fina. Em seguida, remova o anel de PTFE da base do molde.Em seguida, aqueça as moldes para contrair a bainha e remova as bainhas encolhidas das moldes. Deixe as moldes esfriarem até que sejam utilizadas e armazene-as em um dessecador dentro de uma capela. Usando um conta-gotas, incline as moldes de vidro em 45 graus e goteje a solução de PGS em seu lúmen interno enquanto gira lentamente a molde.Verifique se a solução de PGS escorre pela parede da forma. Se houver um ponto seco, adicione mais PGS. Agora, deixe o THF evaporar na câmara de exaustão por pelo menos 30 minutos. Uma vez que o THF tenha evaporado, cure as formas em uma estufa a vácuo.Após curar por um dia, resfrie as moldes até a temperatura ambiente e mergulhe-as lentamente, na vertical, em água desionizada a 24 graus Celsius. Incliná-las muito rapidamente cria bolhas de ar, que rompem o suporte. Transfira cuidadosamente as moldes para o banho de água.Posicione-os em um ângulo utilizando um tubo de silicone e deixe o ácido hialurônico dissolver por uma hora. Se após uma hora o ácido hialurônico não tiver se soltado do molde, com o molde ainda submerso, use uma espátula para empurrar lentamente o ácido hialurônico para fora a partir de ambas as extremidades e, em seguida, agite lentamente o molde. Agora, verifique se as estruturas não se deslocaram dentro do molde de vidro; caso tenham se movido, puxe lentamente a estrutura com pinça para soltá-la do molde.Em seguida, lixivie as partículas de sal transferindo cuidadosamente os escafandros delicados para um banho de água desionizada com agitação suave. Este processo levará pelo menos três dias e exige a troca diária da água. Após a total remoção do sal, transfira cada escafandro para um tubo de centrífuga de 15 mililitros cheio com água desionizada e congele-os em uma caixa de gelo seco por uma hora. Coloque os tubos de centrífuga congelados em um liofilizador por três dias com as tampas abertas.Uma vez liofilizados, armazene os suportes em um dessecador até que sejam utilizados. Comece cortando os suportes em comprimentos de 25 a 30 milímetros. Em seguida, prepare dois tampões de borracha de silicone passando tubos de PTFE pelos orifícios centrais de cada tampão.Em seguida, corte comprimentos de um milímetro e meio do anel hs e deslize um comprimento para uma das extremidades do suporte. Empurre um tubo de PTFE ligado à rolha para dentro da mesma extremidade do suporte, com sobreposição suficiente apenas para ficar sob o anel HS, conectando firmemente o suporte ao tubo, contraia o anel HS em um forno e deixe o conjunto esfriar até a temperatura ambiente. Agora, um tubo de policarbonato de 50 milímetros, que funciona como a câmara do biorreator, é encaixado sobre o suporte e fixado na superfície interna da rolha de borracha de silicone.Assim como antes, outro tubo de PTFE e rolha são fixados na outra extremidade do suporte com um anel hs para completar a câmara. A segunda rolha é conectada à outra extremidade do tubo de policarbonato. Em seguida, as superfícies externas das rolhas são ligadas a duas placas de liga de alumínio.Insira dois hastes roscadas nos orifícios laterais de cada placa e fixe as placas com parafusos de polegar. Fixe o suporte ao biorreator. Em seguida, meça o comprimento visível de cada suporte, que é a distância entre os dois anéis hs, e calcule suas áreas superficiais internas.Para o semeadura celular. Em uma autoclave, esterilize as câmaras, cada uma envolvida individualmente em folha de alumínio, juntamente com cada parte da unidade do biorreator. Após a esterilização, monte o biorreator dentro de uma cabine de cultura celular.Pré-trate e lave o suporte com uma série de perfusões utilizando uma bomba peristáltica a um milímetro por minuto no circuito de fluxo. Inicie lavando com etanol 70%, etanol 50% e, em seguida, etanol 25%, durante uma hora cada. Após as três lavagens com etanol, realize uma lavagem com PBS por duas horas.Por fim, perfundir o biorreator com meio de cultura para células musculares lisas durante 24 horas, após o que estará pronto para o semeadura celular e experimentação. Agora, seguindo as instruções no manuscrito acompanhante, semear o biorreator com 2 milhões de células por centímetro quadrado e, ao longo dos próximos 21 dias, trocar o meio do tubo e fazer ajustes na velocidade da bomba. Gradualmente, a pressão no constructo aumentará de cerca de quatro milímetros de mercúrio no primeiro dia de cultura para mais de 100 milímetros de mercúrio após duas semanas em cultura; após três semanas de cultura, colher as células e prepará-las para análise conforme especificado no manuscrito acompanhante.Essas estruturas tubulares de PGS foram fabricadas pelo método de fusão com sal. Micrografias eletrônicas de varredura demonstraram que todas as estruturas apresentavam espessuras de parede homogêneas e não havia defeitos parciais em suas seções transversais. Macroporos e microporos distribuídos aleatoriamente foram observados na superfície luminal de todas as estruturas.Após o cultivo celular, as camadas múltiplas de MLCs cresceram com orientação perpendicular à direção do fluxo. Além disso, as células e as proteínas de MCD cobriram completamente a luz de todas as estruturas de PGS. A autofluorescência da elastina também mostrou fibras elásticas organizadas circunferencialmente na superfície luminal da estrutura.Após assistir a este vídeo, você deverá compreender como fabricar um suporte tubular poroso, visualizar as células e cultivar o suporte utilizando um biorreator pré-projetado.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nosso grupo desenvolveu um sistema de cultura biorreator que imita as tensões pulsátil fisiológica do sistema cardiovascular para regenerar implantáveis ​​de pequeno diâmetro enxertos vasculares.

Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

Este protocolo é focado na utilização a capacidade inerente de células estaminais para tomar cue a partir de sua matriz circundante extracelular e ser induzidas a diferenciar-se em múltiplos fenótipos. Este manuscrito métodos estende nossa descrição e caracterização de um modelo utilizando um hidrogel de camada dupla, composto de PEG-fibrina e colagénio, ao mesmo tempo, co-diferenciar células-tronco...

Engenharia de um hidrogel de camada dupla para controlar a diferenciação ASC

Síntese e fabricação de fibras longas electrospun abrangendo uma área maior depósito através de um coletor recém-concebido a partir de um polímero biodegradável romance chamado poli (glicerol-dodecanoato) (PGD) foi relatado. As fibras eram capazes de suportar o crescimento de células derivadas de células-tronco pluripotentes.

Electrospun fibrosa Andaimes de Poli (glicerol-dodecanedioate) para Engenharia Neural tecidos de rato as células estaminais embrionárias

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar engenharia de tecidos enxertos de vasos que são funcionais para enxerto em camundongos por semeadura dupla parcialmente célula-tronco pluripotentes induzidas (PPCPE) - derivados de células musculares lisas e PPCPE - células endoteliais derivadas em um biorreator descelulada navio andaime.

Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

Os andaimes para engenharia de tecidos precisam recapitular o complexo microambiente bioquímico e biofísico do nicho celular. Aqui, mostramos o uso de fibras de complexação de polieletrólitos interfaciais como uma plataforma para criar andaimes poliméricos compostos e multicomponentes com liberação bioquímica sustentada.

Andaimes de mistura de fibras Interfacial polieletrólito para lançamento Temporalmente controlada de biomoléculas

Um andaime engenharia de tecidos injectáveis ​​compostas de poli (N-isopropilacrilamida), sulfato de condroitina--graft (PNIPAAm-g-CS) molecular contendo micropartículas de alginato foi preparada. A força de aderência, propriedades e inchaço na biocompatibilidade in vitro são analisadas neste estudo. As técnicas de caracterização desenvolvidos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

Síntese de termogelificantes poli (N-isopropilacrilamida) -graft-condroitina Composites Sulfato com alginato micropartículas para Engenharia de Tecidos

Neste trabalho, scaffolds de poli(ácido lático)/polietilenoglicol (PLA/PEG) foram preparados usando uma combinação de mistura de fusão e lixiviação seletiva. O método aqui discutido permitiu desenvolver andaimes de três camadas, controlando altamente a porosidade e o tamanho dos poros. As propriedades mecânicas também foram avaliadas em ambiente fisiológico.

A Facile e Eco-friendly rota para fabricar poli (ácido láctico) Scaffolds com Graded Pore Tamanho

Um protocolo passo a passo para ensaios não destrutivos e longo período de acompanhamento do processo de remodelação vascular e degradação de andaime na cultura em tempo real de biodegradáveis poliméricos baseados em andaime engenharia de tecidos dos vasos sanguíneos com estimulação pulsátil usando a tomografia de coerência óptica é descrito aqui.

Monitoramento não destrutiva de desenvolvimento degradáveis baseados em andaime engenharia de tecidos dos vasos sanguíneos, usando a tomografia de coerência óptica

Apresentado aqui é um simples de usar, Core/Shell, tridimensional bioprinting set-up para uma etapa de fabricação de andaimes ocas, adequado para a engenharia de tecidos vasculares e outras estruturas tubulares.

Núcleo/Shell impressão scaffolds para engenharia de tecidos de estruturas tubulares

A reconstrução do esôfago é um procedimento desafiador, e o desenvolvimento de um esôfago projetado por tecido que permite a regeneração da mucosa esofágica e muscular e que pode ser implantado à medida que um enxerto artificial é necessário. Aqui, apresentamos nosso protocolo para gerar um esôfago artificial, incluindo fabricação de andaimes, cultivo de bioreatores e várias técnicas cirúrgicas.

Enxerto projetado por tecido para reconstrução circunferencial do Esôfago em Ratos

O objetivo deste protocolo é executar uma co-cultura dinâmica de macrófagos humanos e miofibroblasts em andaimes eletroscarados tubulares para investigar a regeneração de tecidos conduzidos por materiais, usando um bioreator que permite o desacoplamento do estresse da tesoura e do estiramento cíclico.

Um Bioreator multi-cue para avaliar a capacidade inflamatória e regenerativa de biomateriais sob fluxo e estiramento

Aprenda a fabricar andaimes tubulares porosos de elastômeros biodegradáveis para engenharia de tecidos arteriais. Este método utiliza células musculares lisas vasculares em bioreator de fluxo pulsátil para produzir matriz extracelular nativa.

PGS elastomérico Andaimes em Engenharia de Tecidos Arterial

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