PGS elastomérico Andaimes em Engenharia de Tecidos Arterial
8 de abril de 2011
Andaimes elastomérico PGS com células musculares lisas vasculares cultivadas em biorreator fluxo pulsátil pode levar a promissora construções de pequeno diâmetro arterial com a produção de ECM nativas em um período relativamente curto cultura.
Este vídeo mostra como fabricar andaimes tubulares porosos e submetê-los a condicionamento mecânico dinâmico para engenharia de tecidos arteriais. Isso é feito primeiro fabricando os andaimes usando um elastômero biodegradável e um método de fusão de assalto. Os andaimes são então preparados para a semeadura celular e montados em um sistema de biorreator.
No biorreator, as células musculares lisas vasculares semeiam os andaimes e são cultivadas. Semanas depois, o tecido é colhido e analisado por microscopia eletrônica de varredura, coloração h e e e autofluorescência de elastina. O músculo liso resultante é multicamadas e orientado perpendicularmente.
A principal vantagem desta técnica, existente como o branqueamento de partículas, é usar o molde de vidro para fabricá-lo andaime tubular poroso e ácido hialurônico. À medida que um molde é excluído, o molde do andaime é preparado a partir de um pedaço de tubo de vidro. Coloque o tubo em um suporte e despeje a solução de ácido hialurônico preparada no dia anterior no tubo.
O ácido hialurônico flui lentamente ao longo da parede interna. Quando atingir o fundo do molde, vire-o. Repita esta etapa até que a parede interna do molde seja uniformemente revestida pela solução.
Após o revestimento, seque todos os moldes de vidro preparados em um forno a vácuo a 37 graus Celsius por 24 horas. Normalmente, quatro moldes são preparados simultaneamente enquanto os moldes de vidro secam. Prepare as partículas de sal, triture e as partículas de sal SVE a 25 a 32 micrômetros.
No dia seguinte, monte o mandril do molde de vidro preparado, a tubulação de PTFE, a luva termoencolhível e o anel de PTFE. Primeiro, carregue o mandril em comprimentos de 65 milímetros de tubo de PTFE e asse-os a 120 graus Celsius por cinco minutos. Para encolher o PTFE enquanto esperava antes da guerra, uma incubadora de hibridização a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos.
Uma vez que a tubulação tenha envolvido os mandris, empurre a luva termorretrátil no mandril para que ela se mova livremente. Em seguida, coloque o mandril dentro do molde de vidro e prenda o anel APTFE na parte inferior do mandril. Verifique se o anel de PTFE está bem encaixado na parte inferior do molde de vidro.
Em seguida, usando uma espátula e um funil de borracha de silicone, adicione mingaus de partículas de sal ao molde de vidro. Em seguida, bata suavemente no molde com a espátula para uma distribuição uniforme das partículas e raspe o excesso de sal. Agora desligue a incubadora aquecida e carregue-a rapidamente Com os moldes embalados com sal, o sal se fundirá nos próximos 30 minutos, após o que secará os moldes em um forno a vácuo a 37 graus Celsius por 24 horas.
No dia seguinte após o resfriamento, remova o mandril de aço inoxidável dos moldes empurrando-o para fora enquanto prende o anel de PTFE. Se necessário, use um alicate de bico fino. Em seguida, remova o anel de PTFE da parte inferior do molde.
Em seguida, asse os moldes para encolher a manga e remova as mangas encolhidas dos moldes. Deixe os moldes esfriarem até que sejam usados e guarde-os em um desidratado em um exaustor. Usando o conta-gotas apo, incline os moldes de vidro a 45 graus e solte a solução PGS em seu lúmen interno enquanto gira lentamente o molde.
Verifique se a solução PGS flui ao longo da parede do molde. Se houver uma mancha seca, adicione mais PGS Agora deixe o THF evaporar no exaustor por pelo menos 30 minutos. Assim que o THF acabar, cure os moldes em um forno a vácuo.
Após a cura por um dia, resfrie os moldes à temperatura ambiente e, lenta e verticalmente, mergulhe-os em água deionizada a 24 graus Celsius. Incliná-los muito rapidamente cria bolhas de ar, que rasgam o andaime. Transfira cuidadosamente os moldes para o banho-maria.
Posicione-os em ângulo usando um tubo de silicone e deixe o ácido hialurônico se dissolver por mais de uma hora. Se depois de uma hora o ácido hialurônico não tiver se soltado do molde, com o molde ainda submerso, use uma espátula para empurrar lentamente o ácido hialurônico de ambas as extremidades e, em seguida, agite lentamente o molde. Agora, verifique se os andaimes não se moveram dentro do molde de vidro e, em caso afirmativo, puxe o andaime lentamente com uma pinça para soltá-lo do molde.
Em seguida, lixivie as partículas de sal transferindo cuidadosamente os delicados andaimes para um banho-maria deionizado com agitação suave. Isso levará pelo menos três dias e requer que a água seja trocada diariamente Depois que todo o sal for lixiviado, transfira cada andaime para um tubo de centrífuga de 15 mililitros cheio de água deionizada e congele-os em uma caixa de gelo seco por uma hora. Coloque os tubos de centrífuga congelados em um liofilizador por três dias com as tampas abertas.
Depois de liofilizados, armazene os andaimes em um desidratado até que sejam usados. Comece cortando os andaimes em comprimentos de 25 a 30 milímetros. Em seguida, prepare duas rolhas de borracha de silicone alimentando o tubo de PTFE pelos orifícios do meio de cada rolha.
Em seguida, corte um milímetro e meio de anel hs e deslize um comprimento em uma extremidade do andaime. Empurre um tubo de PTFE preso à rolha na mesma extremidade do andaime com sobreposição suficiente para ficar sob o anel HS para conectar firmemente o andaime à tubulação, encolha o anel HS em um forno e deixe o conjunto esfriar até a temperatura ambiente. Agora, um tubo de policarbonato de 50 milímetros, que funciona como a câmara do biorreator, é deslizado sobre o andaime e preso na superfície interna da rolha de borracha de silicone.
Assim como antes, outro tubo de PTFE e rolha são fixados na outra extremidade do andaime com um anel hs para completar a câmara. A segunda rolha é fixada na outra extremidade do tubo de policarbonato. Em seguida, as superfícies externas das rolhas são fixadas a duas placas de liga de alumínio.
Alimente duas hastes roscadas no orifício lateral de cada placa e prenda as placas com parafusos de aperto manual. Anexe o andaime ao biorreator. Agora meça o comprimento visível de cada andaime, que é a distância entre dois anéis hs, e calcule suas áreas de superfície interna.
Para semeadura celular. Em uma autoclave, esterilize as câmaras, cada uma embrulhada individualmente em papel alumínio, juntamente com cada parte da unidade do biorreator. Uma vez esterilizado, montou o biorreator dentro de uma capa de cultura de células.
Pré-trate e enxágue o andaime com uma série de perfusões usando uma bomba peristáltica a um milímetro por minuto no circuito de fluxo. Comece enxaguando com 70% de etanol, 50% de etanol e depois 25% de etanol por uma hora cada. Siga os três enxágues com etanol com um enxágue PBS de duas horas.
Finalmente, perfunda o biorreator com meio de cultura SMC por 24 horas, após o que está pronto para semeadura e experimentação celular. Agora, seguindo as instruções do manuscrito anexo, semeie o biorreator com 2 milhões de células por centímetro quadrado e, nos próximos 21 dias, troque o meio da tubulação e faça ajustes na velocidade da bomba. Gradualmente, a pressão na construção aumentará de cerca de quatro milímetros de mercúrio no primeiro dia de cultura para mais de 100 milímetros de mercúrio após duas semanas em cultura, após três semanas em cultura, colha as células e prepare-as para análise conforme especificado no manuscrito anexo.
Esses andaimes tubulares PGS foram fabricados pelo método de fusão de sal. As micrografias eletrônicas de varredura demonstraram que todos os andaimes tinham espessuras de parede homogêneas e não havia defeitos parciais em suas seções transversais. Macro e microporos distribuídos aleatoriamente foram observados na superfície luminal de todos os andaimes.
Após a cultura de células, SMCs multicamadas cresceram com uma orientação perpendicular à direção do fluxo. Além disso, as células e as proteínas DCM cobriram completamente o lúmen de todas as construções de PGS. A autofluorescência da elastina também mostrou fibras elásticas circunferencialmente organizadas na superfície luminal do construto.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter entendido como fazer andaimes tubulares porosos, ver as células e o andaime de cultura usando um biorreator pré-projetado.
Visão Geral
Este estudo demonstra a fabricação de scaffolds tubulares porosos para engenharia de tecido arterial usando elastômeros biodegradáveis. Os scaffolds são cultivados com células de músculo liso vascular em um biorreator de fluxo pulsátil, levando à produção de matriz extracelular nativa em um curto período de cultura.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Engenharia de Tecidos
- Biomateriais
- Biologia Vascular
Fundamentos
- Scaffolds elásticos são essenciais para criar construtos arteriais de pequeno diâmetro.
- O condicionamento mecânico dinâmico melhora o desenvolvimento do tecido.
- Células de músculo liso vascular desempenham um papel crucial na integração do scaffold.
- A produção de ECM nativa é vital para a engenharia de tecidos funcionais.
Objetivo do Estudo
- Fabricar e condicionar scaffolds tubulares porosos para aplicações arteriais.
- Avaliar a viabilidade e funcionalidade das células de músculo liso vascular em construtos engenheirados.
- Avaliar a produção de ECM nativa em um ambiente de biorreator.
Métodos Utilizados
- Fabricação de scaffolds usando elastômeros biodegradáveis e lixiviação de partículas de sal.
- Condicioamento mecânico dinâmico em um biorreator de fluxo pulsátil.
- Semeadura de células com células de músculo liso vascular.
- Análise do tecido colhido usando microscopia eletrônica de varredura e coloração histológica.
Principais Resultados
- Sucesso na fabricação de tecido de músculo liso multicamadas e orientado.
- Demonstração da integração eficaz das células dentro dos scaffolds.
- Produção de scaffolds com características significativas de ECM nativa.
- Estabelecimento de um método confiável para criar construtos arteriais de pequeno diâmetro.
Conclusões
- O estudo apresenta uma abordagem promissora para a engenharia de tecido arterial.
- O condicionamento dinâmico melhora significativamente o desenvolvimento do tecido.
- Aplicações futuras podem incluir a translação clínica para enxertos vasculares.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Elastomeric scaffold technologies address critical limitations in small-diameter arterial graft development by improving compliance and reducing thrombotic risk. This approach supports predictive confidence in preclinical vascular models through enhanced extracellular matrix deposition and cellular alignment under physiological mechanical conditioning. The method enables mechanistic de-risking of arterial tissue constructs prior to lead identification stages in cardiovascular therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular smooth muscle cell responses to elastomeric substrates and dynamic mechanical cues.
- Operational Value: Provides reproducible porous tubular scaffolds with consistent wall thickness for standardized preclinical testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable extracellular matrix outputs including elastin autofluorescence and collagen deposition for assay readiness.
- Operational Value: Supports scalable scaffold fabrication via salt fusion method for multi-well or bioreactor-integrated screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates perfusion-conditioned smooth muscle alignment and multilayered tissue formation relevant to native artery morphology.
- Operational Value: Establishes a bioreactor-compatible workflow for longitudinal assessment of graft maturation and mechanical stability.
Pipeline & Workflow Integration
The scaffold fabrication and conditioning process integrates into early discovery workflows by providing compliant, thromboresistant vascular models for target validation and lead optimization in arterial disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of elastomeric biomaterials on vascular cell phenotype and extracellular matrix production.
- Screening: Enables standardized assessment of scaffold-cell interactions under pulsatile flow conditions for assay reproducibility.
- Analytics: Delivers quantitative readouts including elastin deposition, cell orientation, and scaffold porosity for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-stage scaffold maturation to preclinical continuity through native-like tissue development under mechanical conditioning.
- Enterprise Reuse: Positions the salt fusion and bioreactor conditioning method as a reusable platform for multiple vascular tissue engineering initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in graft performance through compliance-matched elastomeric scaffolds and physiological conditioning.
- Operational Value: Standardized, reproducible scaffold fabrication with tunable porosity and thickness for cross-team consistency.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk via early identification of non-thrombogenic, elastogenic vascular constructs.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of arterial graft candidates based on preclinical extracellular matrix maturation and cellular alignment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial synthesis, scaffold fabrication, and bioreactor operation.
- Depends on vacuum ovens, perfusion systems, and histological analysis infrastructure.
- Necessitates standardization of salt particle size, PGS solution concentration, and conditioning duration across laboratories.
- Involves adaptation considerations for different cell types or vessel diameters beyond baboon smooth muscle cells.
- Practical limitations include multi-day salt leaching and lyophilization steps affecting throughput.
