Name: Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprenda a engenharia de enxertos vasculares biológicos usando um biorreator pulsátil com células musculares lisas em andaimes de PGA biodegradáveis. Este método promove a regeneração de vasos implantáveis para cirurgias de bypass arterial.

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Este trabalho é financiado pelo National Institutes of Health Grant R01 EB-008836 e R01 HL083895 (tanto para LEN). Poderíamos agradecer a Daryl Smith, o Glassblower University, para fazer o biorreatores para a nossa pesquisa.

Autoclave Montar e autoclave a tubulação para o sistema de fluxo e componentes biorreator (biorreator si ea tampa rolha de silicone) conforme as instruções na Figura 1 e Figura 2. Alimentação por sonda tem um conector macho em uma extremidade e uma extremidade aberta do outro lado. Três segmentos de tubos curtos são inseridos através de uma tampa de silicone para a troca de gás. 1. Costura PGA Malha <ol><li> Corte PGA malha para 1,1 centímetros x ~ folha de 8 cm (dependendo do tamanho biorreator). </li><li> Tubo de silicone Limpo (diâmetro interno de 3 mm) com água destilada (Dh20) e ar seco antes do uso. </li><li> Use sutura Dexon 6,0 a costurar PGA mesh ao redor do tubo de silicone limpa começando com três nós cirúrgico seguido de pontos simples. </li></ol> 2. PGA Andaimes Tratamento de Superfícies <ol><li> Dip andaimes PGA em NaOH 1M por 1-2min e registrar o tempo de tratamento e usar o mesmo tempo para todos os andaimes PGA. </li><li> Enxágüe PGA andaimes em banhos dH2O por 2 minutos 3 vezes. </li><li> Pat PGA andaimes seco com Kimwipes entre cada mergulho na dH 2 banheiros O. </li><li> Seca PGA andaimes sob a capa de cultura de tecidos para o ar seco por 15 minutos com ventilador ligado. </li></ol> 3. Costura braços Dacron <ol><li> Use sutura Prolene 4.0 para costurar pequenos pedaços de cuffs de Dacron (1cm) em cada extremidade da malha PGA com uma sobreposição de 2-3mm. Nota: tenha cuidado para não perfurar tubos de silicone (Figura 3). </li><li> Use a sutura mesmo a costurar três pontos ao redor da extremidade livre de algemas Dacron. Certifique-se de deixar suturas suficiente nas extremidades livres de sutura Prolene para o passo 5.1 (Figura 3). </li></ol> 4. Montagem de biorreator (dia antes do início da cultura biorreator) <ol><li> Mergulhe malha costurada e tubos de silicone, instrumentos cirúrgicos, e um fio fino em um banho de etanol 70% por 20-30 minutos. </li><li> Abrir a autoclave bolsas contendo o biorreator e submergir-lo em banho de etanol 70% por pelo menos 30 minutos antes da montagem. Certifique-se de lavar o biorreator exaustivamente com etanol. Exposição de todos os componentes biorreator para o etanol 70% é um passo além da esterilização. Esta etapa também remove endotoxinas, que não é removido por autoclavagem e é prejudicial para as células vasculares. </li><li> Puxe tubo de silicone pelo lado de armas usando fio fino para retirá-lo completamente. </li><li> Tome biorreator de banho de etanol (mesh manter submerso em etanol). Corrigir o andaime PGA dentro do biorreator pela fixação cuffs de Dacron sobre os lábios de vidro queimado apertando e amarrar as suturas Prolene (Figura 3). </li><li> Conecte um lado de braços laterais biorreator para conectores através de tubos de silicone. </li><li> Puxe outro lado da tubagem de silicone com tensão suficiente e inserir os restantes dois conectores para tubos de silicone. Segure-se em tubo de silicone firmemente ao inserir conectores! </li><li> Reinserir biorreator em banho de etanol e lave com etanol puxando conectores para fora dos braços laterais. </li><li> Virar biorreator mais e permitir que um molho por 10 minutos. </li><li> Biorreator virar o lado direito para cima e deixe de molho por mais 10 minutos. </li><li> Drene todo o etanol. </li><li> Criou três grandes pratos de Petri (10 cm) em série e biorreator lugar no prato centro para segurar o excesso de etanol pingava das extremidades dos tubos. </li><li> Lave biorreator e PGA malha com água de cultura de tecidos utilizando um 5ml ou 10ml pipeta. Também a água lave cultura de tecidos em tubos de silicone. </li><li> Completamente drenar toda a água em excesso em placas de Petri de cada lado do biorreator. </li><li> Biorreator secar durante a noite na capa com ventilador ligado e OFF UV. </li><li> Notas adicionais: certifique-se barra de agitação estéril é em biorreator. Certifique-se de não "pairar" sobre o biorreator deste ponto em diante, para evitar a contaminação. Corta-se a abundância de tiras de parafilme e mergulhe-os em um banho de etanol 70% pequenas (placa de Petri grandes funciona bem). </li></ol> 5. Dia 1: Configuração biorreator <ol><li> Coloque uma placa de Petri estéreis sobre abertura de cada biorreator para proteger a PGA andaime dentro de contaminantes. </li><li> Montar sistema de fluxo de biorreator, como indicado na figura 4 e parafilme todas as juntas de ligação. <ol><li> Limpe os conectores primeiro com algodão embebido em álcool. </li><li> Anexar porta de injeção no braço, o terceiro não utilizada do biorreator. </li><li> Remover tubos morsa e gravata azul off final da diluição salina definida como perto de Y-junção possível. Puxe fixação de tubo no local para garantir que não haja transferência de líquidos a esta parte do tubo </li><li> Remover saco IV, e anexar tubulação morsa (vermelha) para até final de saco IV. Certifique-se de limpar porta de inserção com álcool limpe primeiro. </li><li> Walrus anexar a um lado do sistema de fluxo (via tubo branco final). </li><li> Inserir torneira de 3 vias no sistema de fluxo. </li><li> Remover transdutor de pressão e conectar-se a torneira de três vias. </li><li> Ligue a outra extremidade do transdutor de pressão para abertura central no saco. </li></ol></li><li> Conectaro biorreator para o sistema de fluxo através do Y-junction. Use uma seringa de 60ml para adicionar 350ml de 1 Fungizone% (Fungizone mistura de 5 ml com 495ml de PBS) para bolsa de soro. </li><li> Aperte o saco IV para lavar o sistema de fluxo, ajustando os galos parar para permitir o fluxo de PBS. Nota: verificar dentro biorreator para garantir que não haja vazamento. </li><li> Re-suspender 8 x10 6 células musculares lisas (cerca de um confluentes T75) em 1.25ml de médio e de sementes em cada scafffold PGA. Certifique-se de suspensão de células tem sido uniformemente pingou sobre a junção PGA malha de Dacron, bem como para o lado inferior da PGA malha. </li><li> Limpe borda do biorreator com álcool limpe via rotação do biorreator para os lados evitar pairando. </li><li> Silicone conjunto da tampa rolha (Figura 2) <ol><li> Peel saco de autoclave para trás com cuidado, tomando cuidado para não expor a parte inferior da tampa. </li><li> Anexar porta de injeção ao tubo de alimentação no conector macho. </li><li> Anexar PTFE 0,20 mM filtros a cada uma das três portas ar. </li><li> Tenha cuidado para não expor / toque de fundo da tampa durante este processo. </li><li> Parafilm a porta de injeção. </li></ol></li><li> Insira a tampa rolha de silicone em biorreator de vidro e certifique-se que o tubo de alimentação no interior do biorreator não toca o andaimes semeado PGA. Parafilme em torno da tampa. </li><li> Lugar biorreator com o sistema de fluxo dentro da incubadora (de lado) e gire o biorreator a cada 5 minutos por 25-30 minutos. </li><li> Encher a câmara de biorreator com 400ml de nossos meios de cultura 10/04, conforme descrito no (Quadro 1). Este meio de cultura é "otimizado" para as artérias suína engenharia. </li></ol> 6. Dia 07/06: Ligar a bomba e primeira alimentação <ol><li> Crescer os andaimes semeado estaticamente, sem qualquer pulsátil bombeamento através do tubo de silicone para 07/06 dias. Não há necessidade de mudança médio ou suplementação de vitamina C durante este tempo. </li><li> Certifique-se que não há fugas de PBS ou dobras da tubulação do sistema de fluxo antes de ligar a bomba. </li><li> Ligue a bomba do sistema de fluxo e certifique-se de ajustar a configuração da bomba para que a pressão lê aproximadamente 270/-30mmHg. </li><li> Pressões registro diário em toda a cultura e manter a pressão na 270/-30mmHg. Transdutor de pressão pode ser conectado a um computador para ler e monitorar a pressão. </li></ol> Alimentação primeira <ol start="5"><li> Montar a injeção porta e PTFE filtro para alimentação de tampas tanto para a mudança de médio e médio fins resíduos destituição. </li><li> Coloque o tubo de alimentação firmemente na bomba e coloque uma extremidade à porta de alimentação do biorreator ea outra extremidade à tampa de alimentação. Certifique-se de limpar as portas de injeção com toalhetes de etanol. </li><li> Usar um dual-direcional bomba Masterflex a bomba de fora 200ml de meio. Em seguida, use um tubo de alimentação nova bomba de 200ml de meio fresco de volta para o biorreator. Sempre começar com uma velocidade muito lenta, especialmente quando o bombeamento de volta para o meio biorreator. </li><li> Mudança de médio e complementar 2x/semana ácido ascórbico. Para adicionar o ácido ascórbico, use uma seringa de 30ml para tirar 25ml de meio e colocá-la de lado na capa de tecido. Dissolver 25 mg de ácido ascórbico em 5ml de PBS e filtrá-la através de um filtro de 0,22 mM. Primeiro injetar o ácido ascórbico estéril no tubo de alimentação e adicionar novamente o meio de 25ml retirado anteriormente. A receita média é dada na Tabela 1. </li></ol> 7. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A tubulação e conectores para a montagem do sistema de fluxo é mostrado acima. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. O conjunto da tampa rolha de silicone é mostrado acima. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Esquemas de montagem biorreator são mostrados acima. Dentro do cuffs de Dacron biorreator são fixados para os braços de vidro com os nós de sutura azul. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Sistema de fluxo conectado à tubulação e biorreator é mostrado acima. L/S18 tubulação será bombeada por uma bomba Masterflex e, portanto, dirigir o fluxo. O transdutor de pressão medirá a pressão antes de entrar no biorreator de fluxo superior. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Imagem do navio colhido de engenharia. Vasos Engineered aparecerá para ser opaco e atingir uma espessura de parede de aproximadamente 250μm após 8 semanas de cultura em condições pulsátil. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Hematoxilina e eosina secções transversais dos vasos de engenharia. A e B são de 8 semanas não-pulsado e pulsado vasos, respectivamente.C e D são quatro semanas de embarcações não-pulsado e pulsado, respectivamente. L indica o lado luminal dos vasos. A barra de escalas é 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Manchas tricrômico de Masson para colágeno (azul) para seções transversais dos vasos de engenharia. A e B são de 8 semanas, os navios não-pulsado e pulsado, respectivamente. C e D são quatro semanas de embarcações não-pulsado e pulsado, respectivamente. Note-se que o navio de 4 semanas pulsado mostra mais colágeno do que suas contrapartes não-pulsado. Setas brancas apontam para fragmentos restantes PGA nos vasos. A barra de escalas é 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Coloração imunoquímica de marcadores SMC em bovinos artérias de engenharia. Músculo liso α-actina, calponin-1, e de músculo liso cadeia de miosina pesada (SMMHC) são precoces, intermediárias e tardias SMC marcadores contrátil, respectivamente. Até o final de 12 semanas de cultura, as células da parede do vaso expressar SM α-actina e quantidades moderadas de Calponin-1 e SMMHC. A barra de escalas é 20Hm. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> DMEM (DME / baixa modificado) </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> FBS (soro fetal bovino) inativados pelo calor </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1,0 M </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> Vitamina C (dissolvido em PBS ou DMEM) </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Prolina / Glycine / Alanina 25 mg/25 mg/10 mg (dissolvido em 5ml de PBS) </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 1,5 g (dissolvido in1 ml de PBS) </td><td> 1ml </td></tr><tr><td> Penicilina G a 10.000 unidades / ml </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> PDGF-BB (derivado de plaquetas-BB growth factor) em 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> bFGF (fator de crescimento básico de fibroblastos) em 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Componentes de "40-10" médio são apresentados na tabela acima. Com a exceção de PDGF-BB e bFGF, todos os outros componentes estão a ser filtrado por um filtro de 0,2 Hm antes de usar.

<ol><li>Risau, W., Flamme, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Vasculogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).</li>
<li>Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influcence+of+mechanical+Forices+and+Flow+Mechanisms+on+Vessel+Occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).</li>
<li>Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+arteries+grown+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional arteries grown in vitro.</a> Science. 284, 489-493 (1999).</li>
<li>Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+porcine+arteries%3A+Effects+of+scaffold+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).</li>
<li>Mitchell, S. L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+growing+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts.</a> Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).</li>
<li>Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+and+compositions+of+tissue+engineered+and+native+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).</li>
<li>Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).</li>
<li>Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valentín, A., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+Tools+for+Engineering+Collagenous+Tissues+Integrating+Bioreactors%2C+Intravital+Imaging%2C+and+Biomechanical+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).</li>
<li>Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -c, Krause, D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Culture+Medium+on+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+from+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).</li>
<li>Gong, Z. D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28hMSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+Journal%22%5BJournal%5D)">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs.</a> Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).</li>
<li>Poh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+engineered+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Blood vessels engineered from human cells.</a> Lancet. 365, 2122-2124 (2005).</li>
<li>American Heart Association. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biostatistical+fact+sheet%3A+cardiovascular+procedures%22">Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures</a>. , American Heart Association. (2002).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A qualidade dos navios engenharia é em grande parte ditada pela qualidade do SMCs usado em cultura de tecidos. Os aspectos críticos do fenótipo contrátil SMC incluem morfologia, número de passagem baixa, ea capacidade de proliferar no interior do biorreator. Recomendamos que o número de passagem pode ser maior que P3, no momento da semeadura de células para o cadafalso polímero. Além disso, é crucial para confirmar que as fontes de SMC são livres de micoplasma antes do uso. Temos observado que as células contaminadas po...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / Material </th><th> Fornecedor </th><th> Número Catálogo </th></tr><tr><td> FBS (soro fetal bovino), inativado pelo calor </td><td> HyClone </td><td> SH30071 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> rhFGF básica </td><td> R &amp; B </td><td> 234-FSE </td></tr><tr><td> rrPDGF-BB </td><td> R &amp; B </td><td> 520-BB </td></tr><tr><td> Penicilina G </td><td> Sigma </td><td> PENNA </td></tr><tr><td> Sulfato de cobre (II) </td><td> Sigma </td><td> C8027 </td></tr><tr><td> Gylcine </td><td> Sigma </td><td> C8790 </td></tr><tr><td> L-alanina </td><td> Sigma </td><td> A7469-25G </td></tr><tr><td> L-Proline </td><td> Sigma </td><td> P5607-25G </td></tr><tr><td> Ácido ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A4544-25G </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td></tr><tr><td> Stopper de silicone </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06298-24 </td></tr><tr><td> Masterflex tubos L / S </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06508-16, 06508-18 </td></tr><tr><td> Masterflex bomba </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-80 </td></tr><tr><td> Cuff de Dacron </td><td> Maquet </td><td> 174406 </td></tr><tr><td> PGA sentiu </td><td> Concordia </td><td> MO000877-01 </td></tr><tr><td> 4-0 1,5 métrica Surgipro II sutura </td><td> Syneture </td><td> VP-557-X </td></tr><tr><td> 6-0 0,7 sutura Dexon métrica </td><td> Syneture </td><td> 7538-11 </td></tr><tr><td> 0.22μm PTFE filtros </td><td> Whatman </td><td> 6780-2502 </td></tr><tr><td> Três Way Parar cock- </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 593WSC </td></tr><tr><td> Transdutor de pressão </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX212 </td></tr><tr><td> Sacos IV </td><td> Baxter </td><td> R4R2110 </td></tr><tr><td> Conjunto de diluição salina </td><td> Seta </td><td> W20030 </td></tr><tr><td> Tubo de silicone </td><td> Saint-Gobain </td><td> F05027 </td></tr></tbody></table>

engenharia biológica baseado em enxertos vasculares usando um biorreator pulsátil

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Muito esforço tem sido dedicado a desenvolver e fazer avançar a metodologia para regenerar funcional de pequeno diâmetro arterial ignora. No ambiente fisiológico, tanto a estimulação mecânica e química são necessários para manter o bom desenvolvimento e funcionalidade de 1,2 vasos arteriais. Sistemas de cultura biorreator desenvolvido pelo nosso grupo são projetados para suportar a regeneração navio dentro de um ambiente controlado com precisão químico-mecânico que imita a de vasos nativos. Nossa assembléia biorreator e procedimentos de manutenção são bastante simples e altamente repetitivo 3,4. Células musculares lisas (PMEs) são semeados em um ácido poliglicólico tubular (PGA) de malha que é rosqueado ao longo tubo de silicone compatível e cultivadas em biorreator, com ou sem estimulação pulsátil por até 12 semanas. Há quatro principais atributos que distinguem o nosso biorreator de alguns antecessores. 1) Ao contrário dos sistemas outra cultura que simulam apenas o bioquímico em torno dos vasos sanguíneos nativo, nosso biorreator também cria um ambiente fisiológico pulsátil, aplicando tensão radial cíclica para os vasos em cultura. 2) Várias embarcações de engenharia podem ser cultivadas simultaneamente em diferentes condições mecânicas dentro de um ambiente químico controlado. 3) O biorreator permite uma camada mono de células endoteliais (CE) para ser facilmente revestidas no lado luminal dos vasos de engenharia para implantação de modelos animais. 4) Nossas biorreator também pode vasos cultura projetada com diâmetro diferentes variou de 1 mm a 3 mm, salvando o esforço para adaptar cada biorreator individuais para caber um diâmetro específico. Os vasos engenharia cultivadas em nosso biorreator assemelham vasos sanguíneos nativa histologicamente em algum grau. Células nas paredes dos vasos expressam marcadores madura SMC contrátil, como suave cadeia muscular miosina pesada (SMMHC) 3. Uma quantidade substancial de colágeno é depositado dentro da matriz extracelular, que é responsável pela resistência mecânica final das embarcações engenharia 5. Análise bioquímica também indica que o conteúdo de colágeno dos vasos engenharia é comparável à de artérias nativas 6. Importante, o biorreator pulsátil tem constantemente regenerado vasos que apresentam propriedades mecânicas que permitem experiências de implantação bem sucedida em modelos animais 3,7. Além disso, este biorreator pode ser modificado para permitir a avaliação em tempo real e controle de remodelação do colágeno ao longo do tempo, de forma não invasiva, utilizando um microscópio óptico não-linear (NLOM) 8. Para concluir, este biorreator deve servir como uma excelente plataforma para estudar os mecanismos fundamentais que regulam a regeneração funcional de pequeno diâmetro enxertos vasculares.

Nosso grupo desenvolveu um sistema de cultura biorreator que imita as tensões pulsátil fisiológica do sistema cardiovascular para regenerar implantáveis ​​de pequeno diâmetro enxertos vasculares.

Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

Muito esforço tem sido dedicado ao desenvolvimento e ao aprimoramento da metodologia para regenerar bypasses arteriais funcionais de pequeno diâmetro. No estado fisiológico...

O objetivo geral deste procedimento é criar enxertos vasculares baseados em biologia utilizando um sistema de biorreator pulsátil. Isso é realizado preparando um suporte biodegradável a partir de malha de PGA, onde as células crescerão em camadas, e montando-os em uma câmara de biorreator. Os suportes são então semeados com células musculares lisas e uma tampa com entrada de ar e tubo de alimentação selam a câmara do biorreator.O biorreator é então conectado a um sistema de fluxo para fornecer fluxo pulsátil aos vasos no biorreator. No reator, as células crescem nos vasos, que passam por testes imunoquímicos, bioquímicos e mecânicos. As implicações desta técnica estendem-se ao tratamento da doença arterial coronariana, pois este método representa uma abordagem promissora para regenerar enxertos vasculares implantáveis de pequeno diâmetro para bypass arterial.Embora este método possa fornecer informações sobre engenharia vascular, ele pode ser aplicado a outros sistemas orgânicos que estão sujeitos a forças fisiológicas cíclicas. Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades. Será necessário muito treino para dominar completamente as habilidades.Tivemos pela primeira vez a ideia para esta abordagem ao percebermos a importância de aplicar estímulos mecânicos fisiológicos para regenerar construtos engenheirados. A demonstração visual deste método é fundamental, pois o processo de operação do bioreator é difícil de aprender, já que envolve muitas etapas e só pode ser adquirido por meio de uma demonstração detalhada. Para começar, utilize água destilada para limpar seções de 30 centímetros de comprimento de tubo de silicone com diâmetro interno de três milímetros e deixe secar ao ar.Use uma tesoura para recortar uma seção de 1,1 centímetro por oito centímetros da malha de PGA para cada pedaço de tubo, utilizando um hemostato, de modo a prender a malha de PGA ao tubo com sutura Dexon 6,0, fazendo três nós cirúrgicos e, em seguida, pontos simples com o hemostato; a malha fixada forma um suporte de PGA. Lave os suportes mergulhando-os primeiro em hidróxido de sódio 1 M por um a dois minutos e, depois, realizando três mergulhos em água destilada, com dois minutos cada mergulho. Seque-os delicadamente entre as lavagens e deixe-os secar ao ar em uma capela por 15 minutos após a terceira lavagem.Uma vez seco, suturar uma aba de Dacron de um centímetro em cada extremidade da malha com três pontos. Deixar uma sobreposição de dois a três milímetros do tubo e não perfurar o tubo. Certifique-se de deixar cerca de 15 centímetros de fio livre para uso posterior neste protocolo.Todos os componentes do biorreator e ferramentas são autoclavados previamente. No dia anterior ao início do cultivo no biorreator, o biorreator deve ser parcialmente montado: submergir os componentes do biorreator, os suportes, o tubo de silicone em malha, os instrumentos cirúrgicos e um fio fino mais longo que o comprimento do biorreator em banho de etanol 70% por pelo menos 30 minutos enquanto submersos. Utilize o fio para puxar o tubo de silicone através dos braços laterais do reator.Agora retire o biorreator e fixe as estruturas de PGA no interior prendendo os punhos de Dacron sobre as bordas alargadas do vidro. Utilize o excesso de sutura para amarrar cada punho. Em seguida, usando conectores, prenda o tubo de silicone em um lado da estrutura com um par de braços do biorreator e conecte o tubo do outro lado da estrutura aos outros dois braços.Quando os conectores estiverem instalados, puxe-os para fora dos braços laterais e enxágue o biorreator com etanol. Deixe o reator embebido por 10 minutos de cada lado. Coloque o biorreator sobre algumas placas de Petri e enxágue com cultura de tecidos.Enxágue a água. Usando uma pipeta, certifique-se de também lavar a malha e a tubulação. Agora, coloque uma barra de agitação estéril no reator para uso futuro e seque o equipamento durante a noite na capela com o ventilador ligado e a luz UV desligada a partir deste momento.Não se incline sobre o reator, pois isso pode levar à contaminação. Durante a montagem, todos os conectores devem ser limpos com álcool. Antes de fazer as conexões, muitas das juntas são reforçadas com parafilme, que deve ser mergulhado em etanol 70% antes de ser aplicado. Portanto, tenha bastante quantidade de ambos.Como precaução, posicione uma placa de Petri estéril sobre cada abertura do biorreator para proteger a estrutura de PGA no interior contra contaminantes. Agora, inicie a montagem conectando o porto de injeção ao terceiro braço não utilizado do biorreator. Em seguida, conecte a bolsa de soro ao sistema de fluxo.Com o conjunto de tubos em formato de tubarão, amarre a extremidade azul o mais próximo possível da junção em Y e prenda o tubo com um clipe. Conecte o tubo vermelho à extremidade distante do saco de soro. Em seguida, conecte o tubo branco a um dos lados do sistema de fluxo.Insira uma torneira de três vias no sistema de fluxo. Conecte uma extremidade do tubo do transdutor de pressão à torneira e a outra extremidade à abertura central do saco de soro. Para preencher parcialmente o sistema de fluxo e verificar vazamentos, adicione 350 mililitros de PBS e 1% de fungi zone ao saco de soro.Usando uma seringa de 60 mililitros antes ou depois de conectar ao sistema de fluxo, ajuste a torneira de passagem para controlar a direção do fluxo de PBS e comprima o saco para lavar o sistema. Este passo pode ser realizado tanto antes quanto após o alojamento das células. Agora as células podem ser acomodadas no biorreator.Neste exemplo, ressuspenda 8 milhões de células SM, o que equivale a cerca de uma placa T-75 confluente, em 1,25 mililitro de meio e distribua-as uniformemente sobre o suporte de PGA, da junção de Dacron à junção de Dacron. Após adicionar as células, limpe a borda do biorreator com álcool. Evite permanecer sobre o reator.Em seguida, monte cuidadosamente a tampa de rolha de silicone. Certifique-se de não expor a parte inferior da tampa ao removê-la do saco de autoclave ou durante qualquer uma das etapas subsequentes de fixação. Primeiro, conecte o porto de injeção ao tubo de alimentação no conector macho.Em segundo lugar, fixe filtros de PTFE de 0,20 mícron a cada um dos três aeroportos. Terceiro parágrafo, filme o porto de injeção. Insira a tampa de rolha de silicone montada no biorreator de vidro.Certifique-se de que o tubo de alimentação não toque os suportes de PGA posicionados. Em seguida, feche com parafina. Conecte agora o biorreator ao sistema de fluxo e coloque o biorreator e o sistema de fluxo dentro de uma incubadora a 37 graus Celsius.Por 25 a 30 minutos, o reator deve ser colocado de lado e girado a cada cinco minutos. Em seguida, ainda dentro do incubador, preencha a câmara do biorreator com 400 mililitros de meio de cultura 4 a 10 usando uma bomba por meio de um tubo de alimentação. Incube agora os suportes semeados sem qualquer bombeamento pulsátil por seis a sete dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Não há necessidade de troca de meio ou suplementação com vitamina C durante este período antes de ligar a bomba; verifique os tubos quanto a vazamentos ou dobras. Em seguida, ajuste a velocidade da bomba para manter uma pressão entre -30 e 270 milímetros de mercúrio. Monitore e mantenha essa pressão diariamente durante todo o cultivo.As trocas de meio e a suplementação com ácido ascórbico devem ser realizadas duas vezes por semana, enquanto o andamio cresce com bombeamento pulsátil para fornecer meio fresco. Primeiro, fixe o porto de injeção e o filtro de PTFE nas tampas de alimentação, tanto para a troca de meio quanto para a eliminação de meio residual. Em seguida, posicione firmemente o tubo de alimentação na bomba de dupla direção e insira uma extremidade no porto de alimentação do biorreator e a outra extremidade na tampa de alimentação. Agora, inicie lentamente o bombeamento para remover 200 mililitros de meio.Gradualmente, a velocidade da bomba pode ser aumentada. Em seguida, acople um novo tubo de alimentação e comece lentamente a bombear 200 mililitros de meio fresco. Para adicionar ácido ascórbico ao reator, remova 25 mililitros do meio utilizando uma seringa estéril de 30 mililitros.Adicione cinco mililitros de solução estéril de ácido ascórbico e, em seguida, retorne os 25 mililitros. Os vasos projetados parecerão opacos e atingirão uma espessura de parede de aproximadamente 250 mícrons após oito semanas de cultivo. Em condições pulsáteis, a coloração com hematoxilina e eosina dos vasos projetados mostra alterações na morfologia tecidual ao longo do tempo e com o pulso.O lado luminal dos vasos é indicado com uma coloração tri cromática de Masson para colágeno, que mostra que o vaso submetido ao pulso por quatro semanas possui mais colágeno do que seu equivalente sem pulso. Setas brancas apontam para fragmentos remanescentes de PGA nos vasos após 12 semanas. A análise imunoquímica mostra a expressão do marcador precoce de músculo liso alfa-actina, do marcador intermediário de músculo liso calponina 1 e do marcador tardio de músculo liso cadeia pesada da miosina. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em sete a oito horas, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de executar todas as etapas da forma mais limpa e asséptica possível, seguindo este protocolo. Outros métodos, como a modificação da luz dos vasos engenheirados, podem ser realizados para responder a questões adicionais, como a importância da modificação da superfície luminal na manutenção dos vasos engenheirados durante estudos in vivo. Após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de engenharia de tecidos, especialmente engenharia vascular, explorarem meios potenciais para tratar doenças arteriais coronarianas em modelos animais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter enxertos vasculares implantáveis por meio de um cultivo postal dinâmico. Não se esqueça de que trabalhar com hidróxido de sódio pode ser perigoso, e precauções como proteção ocular e uso de jaleco de laboratório devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

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