Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

O objetivo geral deste procedimento é projetar enxertos vasculares de base biológica usando um sistema de biorreator pulsátil. Isso é feito preparando um andaime biodegradável a partir da malha PGA, onde as células crescerão e montando-as em uma câmara de biorreator. Os andaimes são então assentados com células musculares lisas e uma tampa com ar e tubo de alimentação sela a câmara do biorreator.

O biorreator é então conectado a um sistema de fluxo para fornecer fluxo pulsátil aos vasos do biorreator. No reator, as células crescem em vasos que passam por testes imunoquímicos, bioquímicos e mecânicos. As implicações dessa técnica se estendem à terapia da doença arterial coronariana, pois essa técnica é uma abordagem promissora para regenerar enxertos vasculares implantáveis de pequeno diâmetro para bypass arterial.

Embora este método possa fornecer informações sobre a engenharia vascular, ele pode ser aplicado a outros sistemas de órgãos, como estão sob forças fisiológicas cíclicas. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades. Você precisará de muita prática para dominar totalmente as habilidades.

Tivemos a ideia dessa abordagem pela primeira vez quando percebemos a importância de aplicar estimulação mecânica fisiológica para regenerar construções de engenharia. A demonstração visual deste método é crítica, pois o processo de gravação do biorreator é difícil de aprender porque há muitas etapas e só pode ser adquirido por meio de uma demonstração detalhada. Para começar, use água destilada para limpar seções de 30 centímetros de comprimento de tubos de silicone de três milímetros de diâmetro interno e deixe-os secar ao ar.

Use uma tesoura para cortar uma seção de 1,1 centímetro por oito centímetros de malha PGA para cada pedaço de tubo usando um hemostático, de modo que a malha PGA para o tubo com sutura Dexon 6.0 amarre três nós cirúrgicos e siga com pontos únicos com hemostático, a malha segura faz um andaime PGA. Lave os andaimes mergulhando-os primeiro em um hidróxido de sódio molar por um a dois minutos e, em seguida, três mergulhos em água destilada por dois minutos por mergulho. Seque-os entre as lavagens e deixe-os secar ao ar livre em um capuz por 15 minutos após a terceira lavagem.

Depois de seco, suture punhos de Dacron de um centímetro em cada extremidade da malha com três pontos. Deixe uma sobreposição de tubulação de dois a três milímetros e não perfure a tubulação. Certifique-se de deixar cerca de 15 centímetros de sutura livre para uso posterior neste protocolo.

Todos os componentes e ferramentas do biorreator são autoclavados previamente. Um dia antes de iniciar a cultura do biorreator, o biorreator deve ser parcialmente montado, submergir os componentes do biorreator, os andaimes, de modo que a tubulação de silicone de malha, os instrumentos cirúrgicos e um fio fino mais longo que o comprimento do biorreator em banho de etanol a 70% por pelo menos 30 minutos Enquanto submerso. Use o fio para puxar o tubo de silicone através das pistolas do reator.

Agora emergir o biorreator e prender os andaimes PGA dentro, prendendo os manguitos de Dacron sobre os lábios de vidro alargados. Use o excesso de sutura para amarrar cada manguito. Em seguida, usando conectores, prenda o tubo de silicone em um lado do andaime com um par de braços do biorreator e prenda o tubo do outro lado do andaime aos outros dois braços.

Quando os conectores estiverem instalados, puxe-os para fora das armas laterais e lave o biorreator com etanol. Deixe o reator de molho por 10 minutos de cada lado. Coloque o biorreator em algumas placas de Petri e lave-o com cultura de tecidos.

Água de grau. Usando uma pipeta, certifique-se de lavar também a malha e a tubulação. Agora coloque uma barra de agitação estéril no reator para uso futuro e seque o aparelho durante a noite no exaustor com o soprador ligado e o UV desligado a partir deste ponto.

Não se incline sobre o reator, pois isso pode levar à contaminação Durante a configuração, todos os conectores devem ser limpos com álcool. Antes de as fixações serem feitas, muitas das juntas são reforçadas com paraforme, que deve ser embebida em etanol a 70% antes de ser aplicada. Portanto, tenha muitos dos dois.

Pronto, como precaução, coloque uma placa de Petri estéril sobre cada abertura do biorreator para proteger o andaime PGA interno de contaminantes. Agora comece a configuração conectando a porta de injeção ao terceiro braço não utilizado do biorreator. Em seguida, conecte a bolsa IV ao sistema de fluxo.

Com o tubo de morsa definido, amarre a extremidade azul o mais próximo possível da junção em Y e prenda o tubo. Prenda o tubo vermelho na extremidade da bolsa IV. Em seguida, conecte o tubo branco a um lado do sistema de fluxo.

Insira uma torneira de parada de três vias no sistema de fluxo. Conecte uma extremidade do tubo do transdutor de pressão à torneira de parada e conecte a outra extremidade à abertura do meio da bolsa IV. Agora, para encher parcialmente o sistema de fluxo e verificar se há vazamentos, adicione 350 mililitros de PBS e 1%zona de fungos à bolsa IV.

Usando uma seringa de 60 mililitros antes ou depois de conectar o ao sistema de fluxo, ajuste a torneira para controlar a direção do fluxo do PBS e aperte o saco para lavar o sistema. Esta etapa pode ser feita antes ou depois do assento da célula. Agora as células podem ser assentadas em biorreator.

Neste exemplo, o resus suspende 8 milhões de células SM, o que equivale a cerca de um T 75 confluente em 1,25 mililitros de meio e as pinga uniformemente no andaime PGA da junção Dacron à junção Dacron. Depois de adicionar as células, limpe a borda do biorreator com álcool. Evite pairar sobre o reator.

Em seguida, monte cuidadosamente a tampa da rolha de silicone. Certifique-se de não expor a parte inferior da tampa ao removê-la do saco de autoclave ou durante qualquer uma das etapas de fixação a seguir. Primeiro, conecte a porta de injeção ao tubo de alimentação no conector macho.

Em segundo lugar, conecte filtros de PTFE de 0,20 mícron a cada um dos três aeroportos. Terceiro parágrafo, filme a porta de injeção. Insira a tampa da rolha de silicone montada no biorreator de vidro.

Certifique-se de que o tubo de alimentação não toque nos andaimes PGA assentados. Em seguida, sele com paraforme. Agora conecte o biorreator ao sistema de fluxo e coloque o biorreator e o sistema de fluxo dentro de uma incubadora de 37 graus Celsius.

Por 25 a 30 minutos, o reator deve ser colocado de lado e girado a cada cinco minutos. Em seguida, ainda na incubadora, encha a câmara do biorreator com 400 mililitros de quatro a 10 meios de cultura usando uma bomba através de um tubo de alimentação. Agora incube os andaimes semeados sem qualquer bombeamento pulsátil por seis a sete dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Não há necessidade de troca de meio ou suplementação de vitamina C durante esse período antes de ligar a bomba, inspecione a tubulação quanto a vazamentos ou dobras. Em seguida, ajuste a taxa de velocidade da bomba para manter uma faixa de pressão entre 30 e 270 milímetros negativos de mercúrio. Monitore e mantenha essa pressão diariamente durante toda a cultura.

As trocas de meio e a suplementação de ácido ascórbico devem ser feitas duas vezes por semana enquanto o andaime cresce com bombeamento pulsátil para alimentar primeiro o meio fresco, conecte a porta de injeção e o filtro de PTFE nas tampas de alimentação para fins de troca de meio e descarte de resíduos médios. Em seguida, coloque o tubo de alimentação firmemente na bomba direcional dupla e insira uma extremidade na porta de alimentação do biorreator e a outra extremidade na tampa de alimentação. Agora, lentamente, comece a bombear 200 mililitros de meio.

Gradualmente, a velocidade da bomba pode ser aumentada. Em seguida, conecte um novo tubo de alimentação e comece lentamente a bombear 200 mililitros de meio fresco. Para adicionar ácido ascórbico ao reator, remova 25 mililitros de meio usando uma seringa estéril de 30 mililitros.

Adicione cinco mililitros de solução estéril de ácido ascórbico e retorne os 25 mililitros. Os vasos de engenharia média parecerão opacos e atingirão uma espessura de parede de aproximadamente 250 mícrons após oito semanas de cultura. Sob condições pulsáteis, a coloração de hemat, toína e eosina de vasos projetados mostra alterações na morfologia do tecido com o tempo e com a pulsação.

O lado luminal dos vasos é indicado com uma coloração tri CHRO de L masson. Para o colágeno mostra que o vaso pulsado de quatro semanas tem mais colágeno do que sua contraparte sem pulsos, as setas brancas apontam para os fragmentos de PGA restantes nos vasos por 12 semanas. A análise imunoquímica mostra a expressão do marcador precoce do músculo liso alfa actina, do marcador intermediário do músculo liso cal poin one e do marcador tardio do músculo liso miosina cadeia pesada Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em sete a oito horas se for realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar tudo da maneira mais limpa e rigorosa possível após este procedimento. Outros métodos, como a modificação do lúmen dos vasos projetados, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a importância da modificação da superfície luminal na manutenção dos vasos projetados durante estudos in vivo. Após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de engenharia de tecidos, especialmente engenharia vascular, explorarem meios potenciais para tratar doenças arteriais coronarianas em modelos animais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter enxertos vasculares implantáveis por meio de uma cultura postal dinâmica. Não se esqueça de que trabalhar com hidróxido de sódio pode ser perigoso, e precauções como proteção para os olhos e jaleco devem sempre ser usadas durante a realização deste procedimento.