Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

O objetivo geral deste procedimento é criar enxertos vasculares baseados em biologia utilizando um sistema de biorreator pulsátil. Isso é realizado preparando um suporte biodegradável a partir de malha de PGA, onde as células crescerão em camadas, e montando-os em uma câmara de biorreator. Os suportes são então semeados com células musculares lisas e uma tampa com entrada de ar e tubo de alimentação selam a câmara do biorreator.

O biorreator é então conectado a um sistema de fluxo para fornecer fluxo pulsátil aos vasos no biorreator. No reator, as células crescem nos vasos, que passam por testes imunoquímicos, bioquímicos e mecânicos. As implicações desta técnica estendem-se ao tratamento da doença arterial coronariana, pois este método representa uma abordagem promissora para regenerar enxertos vasculares implantáveis de pequeno diâmetro para bypass arterial.

Embora este método possa fornecer informações sobre engenharia vascular, ele pode ser aplicado a outros sistemas orgânicos que estão sujeitos a forças fisiológicas cíclicas. Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades. Será necessário muito treino para dominar completamente as habilidades.

Tivemos pela primeira vez a ideia desta abordagem ao percebermos a importância de aplicar estímulos mecânicos fisiológicos para regenerar construtos engenheirizados. A demonstração visual deste método é fundamental, pois o processo de operação do bioreator é difícil de aprender, já que envolve muitas etapas e só pode ser adquirido por meio de uma demonstração detalhada. Para começar, utilize água destilada para limpar seções de 30 centímetros de comprimento de tubo de silicone com diâmetro interno de três milímetros e deixe secar ao ar.

Use uma tesoura para recortar uma seção de 1,1 centímetro por oito centímetros da malha de PGA para cada pedaço de tubo, utilizando um hemostato, de modo a prender a malha de PGA ao tubo com sutura Dexon 6,0, amarre três nós cirúrgicos e siga com pontos simples com o auxílio do hemostato; a malha fixada forma um suporte de PGA. Lave os suportes mergulhando-os primeiro em hidróxido de sódio 1 M por um a dois minutos, seguido de três mergulhos em água destilada por dois minutos cada. Seque-os delicadamente entre as lavagens e deixe-os secar ao ar em uma capela por 15 minutos após a terceira lavagem.

Uma vez seco, suturar uma aba de Dacron de um centímetro em cada extremidade da malha com três pontos. Deixar uma sobreposição de dois a três milímetros do tubo e não perfurar o tubo. Certifique-se de deixar cerca de 15 centímetros de fio livre para uso posterior neste protocolo.

Todos os componentes do biorreator e ferramentas são autoclavados previamente. No dia anterior ao início do cultivo no biorreator, o biorreator deve ser parcialmente montado: submergir os componentes do biorreator — as estruturas, a malha, a tubulação de silicone, os instrumentos cirúrgicos e um fio fino mais longo que o comprimento do biorreator — em banho de etanol 70% por pelo menos 30 minutos enquanto submersos. Utilize o fio para puxar a tubulação de silicone através dos braços laterais do reator.

Agora retire o biorreator e fixe as estruturas de PGA inserindo os grampos de Dacron sobre as bordas alargadas do vidro. Utilize o excesso de fio para amarrar cada grampo. Em seguida, com conectores, prenda o tubo de silicone em um lado da estrutura a um par de braços do biorreator e conecte o tubo do outro lado da estrutura aos outros dois braços.

Quando os conectores estiverem instalados, puxe-os para fora dos braços laterais e enxágue o biorreator com etanol. Deixe o reator embebido por 10 minutos de cada lado. Coloque o biorreator sobre algumas placas de Petri e enxágue com cultura de tecidos.

Enxágue a água. Usando uma pipeta, certifique-se de também lavar a malha e a tubulação. Agora, coloque uma barra de agitação estéril no reator para uso futuro e seque o equipamento durante a noite na capela com o ventilador ligado e a luz UV desligada a partir deste momento.

Não se incline sobre o reator, pois isso pode levar à contaminação. Durante a montagem, todos os conectores devem ser limpos com álcool. Antes de fazer as conexões, muitas das juntas são reforçadas com parafilme, que deve ser mergulhado em etanol 70% antes da aplicação. Portanto, tenha bastante quantidade de ambos.

Como precaução, posicione uma placa de Petri estéril sobre cada abertura do biorreator para proteger a estrutura de PGA no interior contra contaminantes. Agora, inicie a montagem conectando o porto de injeção ao terceiro braço não utilizado do biorreator. Em seguida, conecte a bolsa de soro ao sistema de fluxo.

Com o conjunto de tubos para morsa, amarre a extremidade azul o mais próximo possível da junção em Y e prenda o tubo com um clipe. Conecte o tubo vermelho à extremidade distante do saco de soro. Em seguida, conecte o tubo branco a um dos lados do sistema de fluxo.

Insira uma torneira de três vias no sistema de fluxo. Conecte uma extremidade do tubo do transdutor de pressão à torneira e a outra extremidade à abertura central do saco de soro. Para preencher parcialmente o sistema de fluxo e verificar vazamentos, adicione 350 mililitros de PBS e 1% de fungi zone ao saco de soro.

Usando uma seringa de 60 mililitros antes ou depois de conectar ao sistema de fluxo, ajuste a torneira de passagem para controlar a direção do fluxo de PBS e comprima o saco para lavar o sistema. Este passo pode ser realizado antes ou após o alojamento das células. Agora as células podem ser acomodadas no biorreator.

Neste exemplo, reconstitua e suspenda 8 milhões de células SM, o que equivale a cerca de uma placa T-75 confluente, em 1,25 mililitro de meio e distribua-as uniformemente sobre o suporte de PGA, do entroncamento de Dacron ao entroncamento de Dacron. Após adicionar as células, limpe a borda do biorreator com álcool. Evite permanecer sobre o reator.

Em seguida, monte cuidadosamente a tampa de rolha de silicone. Certifique-se de não expor a parte inferior da tampa ao removê-la do saco de autoclave ou durante qualquer uma das etapas subsequentes de fixação. Primeiro, conecte o porto de injeção ao tubo de alimentação no conector macho.

Em segundo lugar, fixe filtros de PTFE de 0,20 mícron a cada um dos três aeroportos. Terceiro parágrafo, filme o porto de injeção. Insira a tampa de rolha de silicone montada no biorreator de vidro.

Certifique-se de que o tubo de alimentação não toque os suportes de PGA posicionados. Em seguida, feche com parafina. Conecte agora o biorreator ao sistema de fluxo e coloque o biorreator e o sistema de fluxo dentro de uma incubadora a 37 graus Celsius.

Por 25 a 30 minutos, o reator deve ser colocado de lado e girado a cada cinco minutos. Em seguida, ainda dentro do incubador, preencha a câmara do biorreator com 400 mililitros de meio de cultura 4 a 10 usando uma bomba por meio de um tubo de alimentação. Incube agora os suportes semeados sem qualquer bombeamento pulsátil por seis a sete dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Não há necessidade de trocar o meio ou suplementar com vitamina C durante este período antes de ligar a bomba; inspecione os tubos quanto a vazamentos ou dobras. Em seguida, ajuste a velocidade da bomba para manter uma pressão entre -30 e 270 milímetros de mercúrio. Monitore e mantenha essa pressão diariamente durante todo o cultivo.

As trocas de meio e a suplementação com ácido ascórbico devem ser realizadas duas vezes por semana enquanto o suporte cresce com bombeamento pulsátil para alimentar meio fresco. Primeiro, fixe o porto de injeção e o filtro de PTFE nas tampas de alimentação, tanto para a troca de meio quanto para a eliminação de meio residual. Em seguida, posicione firmemente o tubo de alimentação na bomba bidirecional e insira uma extremidade no porto de alimentação do biorreator e a outra extremidade na tampa de alimentação. Agora, inicie lentamente o bombeamento para remover 200 mililitros de meio.

Gradualmente, a velocidade da bomba pode ser aumentada. Em seguida, acople um novo tubo de alimentação e comece lentamente a bombear 200 mililitros de meio fresco. Para adicionar ácido ascórbico ao reator, remova 25 mililitros do meio utilizando uma seringa estéril de 30 mililitros.

Adicione cinco mililitros de solução estéril de ácido ascórbico e, em seguida, retorne os 25 mililitros. Os vasos projetados parecerão opacos e atingirão uma espessura de parede de aproximadamente 250 mícrons após oito semanas de cultivo. Em condições pulsáteis, a coloração com hematoxilina, eosina e tioina dos vasos projetados mostra alterações na morfologia tecidual ao longo do tempo e com o pulso.

O lado luminal dos vasos é indicado com uma coloração tri cromática de Masson. A coloração para colágeno mostra que o vaso submetido ao pulso por quatro semanas possui mais colágeno do que seu equivalente sem pulso. Setas brancas apontam para fragmentos remanescentes de PGA nos vasos após 12 semanas. A análise imunoquímica mostra a expressão do marcador precoce de músculo liso alfa-actina, o marcador intermediário de músculo liso calponina 1 e o marcador tardio de músculo liso cadeia pesada da miosina. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em sete a oito horas, se for executada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de executar todas as etapas da forma mais limpa e asséptica possível, seguindo este protocolo. Outros métodos, como a modificação da luz dos vasos engenheirados, podem ser realizados para responder a questões adicionais, como a importância da modificação da superfície luminal na manutenção dos vasos engenheirados durante estudos in vivo. Após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de engenharia de tecidos, especialmente engenharia vascular, explorarem meios potenciais para tratar doenças arteriais coronarianas em modelos animais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter enxertos vasculares implantáveis por meio de um cultivo postal dinâmico. Não se esqueça de que trabalhar com hidróxido de sódio pode ser perigoso, e precauções como proteção ocular e uso de jaleco laboratorial devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.