Name: Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a isolar macrófagos de culturas primárias de células do fígado de rato usando perfusão com colagenase e adesão seletiva. Este método simples não requer equipamentos complexos e permite colheitas repetidas.

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Este trabalho foi financiado por uma bolsa de investigação e um Grant-in-Aid do Projeto de Alimentos Nanotecnologia do Ministério da Agricultura, Florestas e Pesca do Japão.

1. Perfusão do Fígado <ol><li> Anestesiar um adulto de ratos Sprague-Dawley do sexo masculino (de 10 a 15 semanas de idade; peso corporal 150-200 g) por uma injeção intraperitoneal de uma solução de pentobarbital sódico (50 mg de sódio pentobarbital / kg de peso corporal). </li><li> Colocar o animal em uma panela inoxidável e spray de etanol a 70% em seu abdômen e tórax. </li><li> Faça um pequeno corte e retire a pele. Abrir o abdômen pelo corte com uma tesoura. </li><li> Confirmar a localização da veia porta, passe um fio cirúrgico sob a veia porta e vagamente moita. </li><li> Moita a parte distal da veia cava inferior e veia mesentérica para evitar o refluxo de sangue para o fígado. Abrir a cavidade torácica, cortando o diafragma com uma tesoura, e expor o coração. </li><li> Inserir um cateter plástico (2 mm de diâmetro) na veia porta e apertar firmemente o fio ao redor do cateter. </li><li> Conectar o cateter a um sistema de perfusão que é carregado com a solução de lavagem (Ca 2 +-Mg 2 + livre HBSS contendo 0,5 mM EGTA, 10 HEPES mM e 4,2 mM NaHCO 3, pH 7,2) pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Comece a perfusão in situ a uma taxa de 10 ml / min. Ao mesmo tempo, faça um corte na parede do átrio direito. Continue perfusão por 10 min. </li><li> Mudar a solução de perfusão para a solução de colagenase [HBSS contendo HEPES 10 mM e NaHCO 3 4,2 suplementado com colagenase tipo I (0,05%) e inibidor de tripsina (50 mcg / ml), pH 7.5], perfundir e por 10 - 20 min a uma taxa de 10 ml / min, até o fígado incha um pouco e mostra o sinal para a desintegração da estrutura do fígado sob membrana serosa. </li></ol> 2. Preparação de Fração celular no parênquima Hepatócito ricos <ol><li> Remover e transferir cuidadosamente o fígado, para um copo estéril contendo 25 ml de solução de colagenase. Picar em pedaços pequenos com tesoura. </li><li> Adicionar 75 ml de MEM frio para a suspensão celular resultante. Após pipetar gentil, filtrado através de um filtro de células (100 mm) para remover o tecido conjuntivo e fragmentos de tecido não digerido. </li><li> Transfira o filtrado para 50 ml tubos cônicos e centrifugar a 50 xg por 1 min a 4 ° C (freio). </li><li> Cuidadosamente desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento com MEM frio. </li><li> Repita 2.4) três vezes. </li></ol> 3. Cultura primária mista de células do fígado <ol><li> Suspender as células obtidas em 2.5) no meio de crescimento composto por DMEM contendo 10% de calor FCS inativada, suplementado com 100 mM β-mercaptoetanol, 10 de insulina mcg / ml, estreptomicina 100 mg / ml e 100 U / ml de penicilina, e sementes em 09:55 frascos de cultura de tecido (superfície: 75 cm 2) com uma densidade de 6,7 x 10 4 células / cm 2 (5 x 10 6 células / frasco / 12 -15 ml de meio). </li><li> Incubar a cultura flasksat 37 ° C em uma atmosfera de 5% CO 2-95% de ar. </li><li> Substituir o meio de crescimento a cada 2 a 3 intervalos de dias. </li></ol> 4. Isolamento seletivo de macrófagos <ol><li> Após 12 dias de cultura, os macrófagos proliferam na folha de celular. Estas células são suspensas por recíproca agitação dos frascos de cultura em 80-120 golpes por minuto por 30 min a 37 ° C. </li><li> Transferência do meio de cultura em 100 milímetros de tecido não-cultura grade pratos de plástico. Piscina meio de dois frascos de T75 em um prato de plástico. Frascos de cultura de recarga com o meio de crescimento e devolvê-los à incubadora. </li><li> Incubar pratos de plástico por 30 min a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO 2-95% de ar. Macrófagos facilmente anexar ao tecido não-cultura pratos grade de plástico no âmbito do presente processo de incubação, enquanto que outras células não contaminar. </li><li> Aspirar a médio e lave o prato de plástico com PBS. Repita este passo três vezes. </li><li> Adicionar 1 ml de solução TrypLE Express para o prato, e incubar por 10 min a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO 2-95% de ar. </li><li> Adicionar 9 ml do meio de crescimento. Delicadamente raspar os macrófagos presa por um raspador de celular. </li><li> Transferir a suspensão de células em um tubo cônico de 15 ml e centrifugar a 180 xg por 5 min a 25 ° C (freio). </li><li> Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 ml do meio de crescimento. Dissociar-se em células isoladas por pipetagem vigoroso. Enumerar o número de células por um hemocitômetro contagem. </li><li> Medidas de isolamento pode ser repetido com a mesma cultura em frascos de 2-3 intervalos de dia para mais de duas semanas. </li><li> Macrófagos isolados podem ser cultivadas em meio de cultura descrito no ponto 3.1. </li></ol> 5. Resultados representante Um exemplo de uma cultura mista primária de células do fígado de ratos adultos é mostrado na Figura 2. Hepatócitos do parênquima perder a morfologia das células epiteliais dentro de poucos dias em cultura, degenerados ou transformar em fibroblasto-como pilhas.Então, por volta do dia 6 a 12, de contraste de fase brilhante, redondo macrófagos como células vigourouly proliferam na camada de células fibroblásticas. Por agitação dos frascos de cultura, os macrófagos são facilmente suspensos no meio de cultura, e sua posterior transferência e incubação em pratos de plástico resultam em adesão seletiva de macrófagos (Figura 3). As células macrófagos-like podem ser colhidas mais cedo dia 8, e os números atingiram níveis máximos nos dias 12 a 14. Mais de 10 6 células podem ser colhidas a partir de uma garrafa de cultura T75 repetidamente em intervalos de 2-3 dias por mais de duas semanas, permitindo um rendimento total de células por frasco de 10 7 por T75 frasco de cultura (Figura 3). A pureza dos macrófagos isolados foram de 95 a 99%, avaliada pelo flowcytometry ou imunocitoquímica com ratos macrófagos anticorpos específicos, como o ED-1 (Figura 4), ​​ED-3, OX-41 (Figura 4) e Iba1 9. As células isoladas mostram características típicas de macrófagos, tais como fagocitose ativa de contas polystylene (Figura 5), a resposta proliferativa a GM-CSF recombinante, a secreção de inflamatórias / citocinas anti-inflamatórias após estimulação com LPS, e formação de células gigantes multinucleadas 9. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Um esquema de isolamento seletivo e purificação de macrófagos como células de cultura primária mista de células de fígado de rato. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cultura primária de células de fígado de rato e proliferação de macrófagos como células. Seta indica uma célula gigantes multinucleadas. Barra de escala = 100 mm. Reproduzido do Jornal de métodos imunológicos, Vol.360, 47-55 (2010) 9 com permissão da Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Isolamento selectivo de macrófagos como células pela agitação e método de fixação. As células foram suspensas em meio de cultura por agitação dos frascos, posteriormente transferida para o tecido não-cultura pratos de plástico de grau, e incubados a 37 ° C. Já em 10 min após o plaqueamento, macrófagos como células aderidas à superfície do prato, enquanto outros contaminar células fibroblásticas permaneceu suspenso. Após lavagem com PBS, uma população de macrófagos altamente purificada foi obtida. Estas células ganhou a morfologia típica de macrófagos após 40 min da cultura, e as células mitóticas foram freqüentemente observadas (setas). Alterações subsequentes no número de células recuperado de frascos em períodos diferentes culturas são mostradas. Os valores são em média ± SD 3-5 frascos. Experimentos foram repetidos três vezes e os dados são indicados por símbolos diferentes. Barra de escala = 100 mm. Reproduzido do Jornal de métodos imunológicos, Vol.360, 47-55 (2010) 9 com permissão da Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Coloração imunocitoquímico dos macrófagos como células com anticorpos monoclonais contra macrófagos de ratos. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Fagocitose de FITC marcado por microesferas de macrófagos como células.

<ol><li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+as+a+lymphoid+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The liver as a lymphoid organ.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).</li>
<li>Roberts, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Kupffer+cell+in+mediating+hepatic+toxicity+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis.</a> Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).</li>
<li>Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver%3A+An+organ+with+predominant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver: An organ with predominant innate immunity.</a> Hepatology. 47, 729-736 (2008).</li>
<li>Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+murine+Kupffer+cells+by+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation.</a> J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).</li>
<li>Olynyk, J. K., Clarke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat Kupffer cells.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).</li>
<li>Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+and+human+Kupffer+cells+by+a+modified+enzymatic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay.</a> J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Yoshioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+expression+of+cytokine+mRNAs+by+lipopolysaccharide+in+bovine+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).</li>
<li>Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+isolation+method+for+macrophage-like+cells+from+mixed+primary+cultures+of+adult+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells.</a> J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).</li>
<li>Gorrell, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fibrosis%3A+the+hepatocyte+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver fibrosis: the hepatocyte revisited.</a> Hepatology. 46, 1659-1661 (2007).</li>
</ol>

Todos os animais foram mantidos e operados na unidade animal no Instituto Nacional de Saúde Animal, de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Comitê da Instituição para experimentos com animais.

Aqui, nós relatamos um método simples e eficiente para obter macrófagos da mistura de culturas primárias de células do fígado de ratos adultos. Nosso método baseia-se primeiro sobre a atividade proliferativa romance de macrófagos na cultura mista de células de fígado de rato, e depois posterior isolamento e purificação dessas células, com base em suas características biológicas como macrófagos 9. Pode ser possível os macrófagos proliferaram na cultura mista primária de células do fígado adulto pode ter se originado a partir de Kupffer ou células relacionadas que contaminou a fração em hepatócitos do parênquima. Os macrófagos podem ter respondido a alterações específicas ambientais causados ​​pela transformação do parênquima hepatócito 10 e outras células fibroblásticas na mistura de culturas primárias. Em conclusão, nosso método proporciona isolamento dos macrófagos como células em número suficiente e pureza da cultura primária de fígado de rato cellswithout usando equipamentos sofisticados e habilidades técnicas. Além disso, o procedimento de isolamento pode ser repetido com o frasco mesma cultura por mais de duas semanas. Esse método pode ser aplicável a outras espécies de mamíferos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Solução de pentobarbital sódico </td><td> Kyoritsu Seiyaku </td><td> Injeção Somnopentyl </td><td></td></tr><tr><td> Solução salina balanceada de Hank (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> Etilenoglicol tetraacetic ácido (EGTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd. </td><td> 032-10534 </td><td> Dissociação celular grade (Lot verifique necessário) </td></tr><tr><td> Inibidor de tripsina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9128 </td><td></td></tr><tr><td> Meio mínimo essencial de Eagle (MEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-4655 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modificado Meio de Eagle (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-6459 </td><td> Alta de glicose do tipo </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino (FCS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Inativados pelo calor a 56 ° C por 30 min. (Lot verifique necessário) </td></tr><tr><td> TrypLE expresso </td><td> Invitrogen </td><td> 12605 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de Dulbecco solução salina tamponada (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td> Ca 2 +-Mg 2 + livre </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-7522 </td><td> Stock: 100 mM em água destilada </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-5500 </td><td> Stock: 10 mg / ml em HCl 0,1 N </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Coador celular </td><td> BD Biosciences </td><td> 352360 </td><td> Malhagem: 100 mm </td></tr><tr><td> Frasco de cultura de tecidos </td><td> Sumitomo Bakelite Co., Ltd. </td><td> MS-21250 </td><td> Superfície: 75 cm 2 </td></tr><tr><td> Não-tecido placas de cultura de plástico </td><td> BD Biosciences </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Scraper celular </td><td> Corning Inc. </td><td> 3010 </td><td></td></tr><tr><td> Shaker recíproco </td><td> TAITEC </td><td> NR-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

um método simples e eficiente para isolar macrófagos de mixed culturas primárias de células do fígado adulto

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Células de Kupffer são macrófagos hepáticos específicos residente e desempenhar um papel importante nas funções fisiológicas e patológicas do fígado 1-3. Embora os métodos de isolamento de macrófagos do fígado têm sido bem descrita 4-6, a maioria destes métodos requerem equipamentos sofisticados, como um elutriator centrífuga e habilidades técnicas. Aqui, nós fornecemos um novo método para obter macrófagos de fígado em número suficiente e pureza da mistura culturas primárias de células do fígado de ratos adultos, como esquematicamente ilustrada na Figura 1. Após a dissociação das células do fígado por duas etapas método de perfusão 7,8, uma fração na sua maioria composta de hepatócitos do parênquima é preparado e semeado em cultura de tecidos T75 frascos com meio de cultura composto por DMEM e 10% hepatócitos FCS.Parenchymal perder a morfologia das células epiteliais dentro de poucos dias em cultura, degenerados ou transformar em fibroblasto-como as células (Figura 2). Como o produto da cultura, por volta do dia 6, de contraste de fase brilhante, redondo macrófagos-like células começam a proliferar na camada de células fibroblásticas (Figura 2). O crescimento das células macrófagos-like continuar e chegar ao nível máximo, em torno de 12 dias, cobrindo a camada de células na superfície do frasco. Por agitação dos frascos de cultura, os macrófagos são facilmente suspensos no meio de cultura. Posterior transferência e incubação curto, em resultado pratos de plástico na adesão seletiva de macrófagos (Figura 3), enquanto que outras células contaminantes permanecem suspensas. Depois de várias lavagens com PBS, os macrófagos são colhidas em anexo. Mais de 10 6 células podem ser colhidas várias vezes da mesma garrafa de cultura de tecidos T75 menos duas a três intervalos dias por mais de duas semanas (Figura 3). Purezas dos macrófagos isolados foram de 95 a 99%, avaliada por citometria de fluxo ou imunocitoquímica com ratos macrófagos anticorpos específicos (Figura 4). células isoladas mostram fagocitose ativa de contas polystylene (Figura 5), ​​a resposta proliferativa a GM-CSF recombinante, a secreção de inflamatórias / citocinas anti-inflamatórias após estimulação com LPS, e formação de células gigantes multinucleadas 9. Em conclusão, nós fornecemos um método simples e eficiente para obter macrófagos de fígado em número suficiente e pureza sem equipamentos complexos e skills.This método pode ser aplicável a outras espécies de mamíferos.

Um novo método para obter macrófagos de cultura primária de células de fígado de rato é descrito. Este método utiliza a proliferação de macrófagos na cultura, seguido por agitação de frascos de cultura e purificação pelo apego seletivo para pratos de plástico. Esta técnica proporciona eficiente macrófagos do fígado, sem equipamentos complexos e habilidades.

Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

As células de Kupffer são macrófagos residentes específicos do fígado e desempenham um papel importante nas funções fisiológicas e patológicas do fígado1-3. Embora ...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter múltiplas culturas de macrófagos a partir de culturas primárias mistas de células de fígado de rato, sem a necessidade de equipamentos complexos ou habilidades especializadas. Isso é alcançado inicialmente por meio da dissociação de células hepáticas de rato adulto por perfusão com colagenase, seguida pelo isolamento da fração celular parenquimatosa de hepatócitos. Em seguida, as células são incubadas em frascos de cultura de tecidos T 75 com meio de crescimento para estabelecer culturas primárias mistas de células hepáticas.Então, após 10 a 12 dias de cultivo, os frascos de cultura são agitados para facilitar a transferência dos macrófagos para placas de plástico, de onde são posteriormente colhidos por adesão seletiva após um breve período de incubação. Finalmente, mais de 10 das seis células podem ser colhidas repetidamente dos mesmos frascos de cultivo tecidual T 75 em intervalos de dois a três dias por mais de duas semanas. Os métodos de isolamento de macrófagos hepáticos já foram bem descritos.No entanto, a maioria dos métodos anteriores exige equipamentos sofisticados, como um ilustrador centrífugo, e habilidades técnicas refinadas. Aqui apresentamos um método simples e inovador para obter macrófagos hepáticos em número e pureza suficientes a partir de culturas primárias mistas de células hepáticas adultas envoltas, que não requer equipamentos especiais nem habilidades laboratoriais avançadas. A dissecação animal, a perfusão do fígado e o preparo dos citos serão demonstrados pelos doutores Norco, Yamanaka e Miko Yoshioka no Instituto Nacional de Saúde Animal.Em seguida, o isolamento e a purificação de macrófagos hepáticos a partir de riscos culturais serão demonstrados pelo Dr. Taketo Takeno no Instituto Nacional de Ciências Agrobiológicas. Vamos começar. Para preparar a perfusão do fígado de rato, inicie pré-aquecendo uma garrafa de solução de lavagem e uma garrafa de solução de colagenase.Em seguida, após confirmar a sedação por meio de pinçamento da pele, posicione uma rata macho adulta anestesiada em uma bandeja de aço inoxidável e pulverize etanol 70% sobre seu abdômen e tórax. A seguir, faça um pequeno corte no meio do abdômen com tesoura de dissecação e retire a pele para trás. Então, abra o abdômen com a tesoura e confirme a localização da veia porta.Em seguida, passe o fio cirúrgico sob a veia porta e aperte-o levemente. Depois, prenda a parte distal da veia cava inferior e da veia mesentérica com uma pinça hemostática fina para impedir o refluxo sanguíneo para o fígado. Abra a cavidade torácica cortando o diafragma com uma tesoura e exponha o coração; após fazer uma pequena incisão na veia porta com tesoura oftálmica, insira um cateter plástico de dois milímetros na veia e aperte firmemente o fio ao redor do cateter.Carregue um sistema de perfusão com a solução de lavagem pré-aquecida e, em seguida, conecte-o ao cateter. Inicie a perfusão em C dois a uma taxa de 10 mililitros por minuto. Ao mesmo tempo, faça um corte na parede do átrio direito com tesoura de dissecação.Continue a perfusão por 10 minutos, depois mude a solução de perfusão para a solução de colagenase e perfunda por 10 a 20 minutos. À taxa de 10 mililitros por minuto, encha um béquer estéril com 25 mililitros de solução de colagenase. Em seguida, remova e coloque cuidadosamente o fígado perfundido no béquer.Pique o fígado em pedaços pequenos com tesoura. Adicione 75 mililitros de MEM frio à suspensão celular resultante. Após pipetagem suave, filtre a suspensão através de um filtro celular de 100 micrômetros.Para remover o tecido conjuntivo nos fragmentos de tecido não digeridos, colete o filtrado em tubos cónicos de 50 mililitros. Transfira o filtrado para tubos cónicos de 50 mililitros e lave as células quatro vezes, primeiro centrifugando as células a 50 Gs durante um minuto a quatro graus Celsius. Com a frenagem desativada, descarte cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, re-suspenda o pellet em MEM frio e centrifugue as células novamente após a última lavagem.Resuspenda as células hepáticas no meio de crescimento. Em seguida, semeie as células em cinco a dez frascos de cultura de tecidos T 75 numa densidade de 6,7 × 10⁴ células por centímetro quadrado. Coloque os frascos de cultura em uma incubadora e substitua o meio de crescimento a cada dois ou três dias.Após um dia de cultivo, os hepatócitos parenquimatosos espalham-se pela superfície do frasco e apresentam morfologia típica poligonal, semelhante a pedras laje, com um ou dois núcleos redondos. Em poucos dias de cultivo, os hepatócitos parenquimatosos perdem sua morfologia de célula epitelial e se transformam em células fibroblásticas mais achatadas. Por volta do sexto dia, células brilhantes e redondas, semelhantes a macrófagos, começam a proliferar sobre a camada de células fibroblásticas. O crescimento das células semelhantes a macrófagos atinge níveis máximos por volta do dia 12.O número de células semelhantes a macrófagos diminui por volta do dia 19, quando a lâmina de células fibroblásticas começa a se degenerar. Assim, por volta de sete a dez dias de cultivo, suspendemos os macrófagos que proliferaram na lâmina celular no meio de cultura mediante agitação recíproca dos frascos de cultura por 30 minutos, após a ressuspensão dos macrófagos. Distribua o meio de dois frascos T75 em cada uma das placas plásticas de 100 milímetros não destinadas à cultura de tecidos.Reabasteça os frascos de cultura com meio de crescimento e devolva-os ao incubador. Incube as placas de plástico por 30 minutos após o período de incubação, lave as placas três vezes aspirando o meio e enxaguando suavemente a placa de plástico com PBS, como visto aqui, já aos 10 minutos após o plaqueamento, células semelhantes a macrófagos aderidas à superfície da placa, enquanto outras células fibroblásticas contaminantes permanecem em suspensão. Após a lavagem com PBS, obtém-se uma população altamente purificada de macrófagos.Como visto nesta figura, as células adquirem morfologia típica de macrófagos após 40 minutos de cultivo, e células em mitose são frequentemente observadas, conforme indicado pelas setas. Para coletar esta nova população altamente purificada de macrófagos, adicione um mililitro da solução trip LE Express às células lavadas e coloque as placas de volta no incubador por mais 10 minutos. Após este período de incubação, adicione nove mililitros de meio de crescimento e, em seguida, desprenda suavemente os macrófagos aderidos com a espátula celular, transfira para um tubo cônico de 15 mililitros, centrifugue e descarte o sobrenadante.Adicione um mililitro do meio de crescimento, dissocie os agregados celulares re-suspensos em células individuais por pipetagem vigorosa, conte o número de células utilizando um hemocitômetro conforme mostrado neste gráfico, mais de 10 das seis células podem ser colhidas de um frasco de cultura T 75 repetidamente em intervalos de dois a três dias por mais de duas semanas, possibilitando um rendimento celular total de 10 elevado a sete por frasco de cultura T 75. Conforme mostrado nestas imagens, as células isoladas são imunomarcadas com anticorpos monoclonais contra antígenos de macrófagos de rato, tais como CD 68 ou ED um e CD 1 72 A ou OX 41. Essas células possuíam propriedades funcionais de macrófagos, como a fagocitose ativa de microesferas marcadas com FITC.Neste vídeo, apresentamos um método simples e eficiente para obter macrófagos a partir de culturas primárias mistas de células hepáticas vermelhas adultas. Nosso procedimento não exige equipamentos ou habilidades complexas, mas fornece quantidades suficientes de macrófagos puros que podem ser coletados repetidamente a partir da mesma cultura de fígado. Este método pode ser aplicado a outras espécies de mamíferos.Obrigado por assistir ao vídeo e boa sorte em seus futuros experimentos. Saúde.

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Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Uma técnica para isolar hepatócitos humanos e células hepáticas não parenquimatosas do mesmo doador é descrita. Os diferentes tipos de células hepáticas constroem a base para modelos funcionais de fígado e engenharia de tecidos. Este novo método visa isolar células hepáticas com alto rendimento e viabilidade.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Um protocolo é apresentado para cultura de células de macrófagos derivados de monócitos humanos diferenciados pelo fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). O protocolo utiliza a criopreservação de monócitos juntamente com sua diferenciação em massa em macrófagos. Em seguida, os macrófagos colhidos podem ser semeados em poços de cultura nas densidades celulares necessárias para a realização de experimentos.

Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

lesões no figado são acompanhadas por expansão de células progenitoras que representa uma população celular heterogénea. classificação Novel deste compartimento celular permite a distinção dos vários subgrupos. O método descrito aqui ilustra a análise de citometria de fluxo e de alta pureza isolamento de vários subconjuntos que podem ser utilizadas para ensaios posteriores.

Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel

Aqui, mostramos uma abordagem enzimática para isolar hepatócitos primários a partir de ratos adultos, e descreve-se a quantificação de uma resposta inflamatória por meio de ELISA e PCR em tempo real.

A indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos

Este protocolo permite que um pesquisador isolar e caracterizar residente em tecido marca de macrófagos em vários tecidos inflamados, extraídos de modelos induzida por dieta de distúrbios metabólicos.

Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

Apresentamos um protocolo para obter assinaturas de proteomic de macrófagos humanos e aplicar isso a determinação do impacto de um ambiente de baixo oxigênio na polarização do macrófago.

Análise de Proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio

Este protocolo é um método eficiente, econômico e robusto de isolar microglia primária de tecido cerebral vivo, adulto e humano. A microglia humana primária isolada pode servir como ferramenta para estudar processos celulares em homeostase e doenças.

Obtenção de Microglia Humana de Tecido Cerebral Humano Adulto

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar a interação de macrófagos primários derivados de monócitos humanos com um esferóide tumoral em uma matriz tridimensional (3D) de colágeno I, com a possibilidade de comparar o impacto das propriedades solúveis e físicas do microambiente na invasão celular.

Um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores

Aprenda a isolar macrófagos de culturas primárias de células do fígado de rato usando perfusão com colagenase e adesão seletiva. Este método simples não requer equipamentos complexos e permite colheitas repetidas.

Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

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