Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

O objetivo geral do experimento a seguir é obter várias culturas de macrófagos a partir de culturas primárias mistas de células hepáticas de ratos sem a necessidade de equipamentos ou habilidades complexas. Isso é conseguido primeiro através da dissociação de células hepáticas de ratos adultos por perfusão de colagenase, seguida pelo isolamento da fração de células de hepatócitos parenquimatosos. Em seguida, as células são incubadas em frascos de cultura de tecidos T 75 com meio de crescimento para estabelecer culturas primárias mistas de células hepáticas.

Então, após 10 a 12 dias de cultura, os frascos de cultura são agitados para facilitar a transferência dos macrófagos para pratos de plástico, dos quais são colhidos por adesão seletiva após um curto período de incubação. Finalmente, mais de 10 das seis células podem ser colhidas repetidamente dos mesmos frascos de cultura de tecidos T 75 em intervalos de dois a três dias por mais de duas semanas. Métodos de isolamento para macrófagos hepáticos têm sido bem descritos.

No entanto, a maioria dos métodos anteriores requer equipamentos sofisticados, como um ilustrador centrífugo e habilidades técnicas refinadas. Aqui apresentamos um método simples e inovador para obter macrófagos hepáticos em número e pureza suficientes a partir de culturas primárias mistas de células hepáticas adultas que não requerem equipamento especial ou habilidades laboratoriais avançadas. A dissecação animal, a perfusão do fígado e a preparação de citos serão demonstradas pelos médicos Norco, Yamanaka e Miko Yoshioka no Instituto Nacional de Saúde Animal.

Em seguida, o isolamento e a purificação de macrófagos hepáticos de riscos culturais serão mostrados pelo Dr. Taketo Takeno no Instituto Nacional de Ciências Agrobiológicas. Então vamos começar. Para se preparar para a profusão do fígado de rato, comece pré-aquecendo um frasco de solução de lavagem e um frasco de solução de colagenase.

Em seguida, após confirmar a sedação por pinça de pele, coloque um rato macho adulto anestesiado em uma panela de aço inoxidável e borrife etanol 70% em seu abdômen e tórax. Em seguida, faça um pequeno corte no meio do abdômen com uma tesoura de dissecação e retire a pele. Em seguida, abra o abdômen com a tesoura e confirme a localização da veia porta.

Em seguida, passe o fio cirúrgico sob a veia porta e aperte frouxamente o fio. Em seguida, clampeie a parte distal da cava vanoc inferior e da veia mesentérica com uma pinça de mosquito para evitar o refluxo sanguíneo para o fígado. Abra a cavidade torácica cortando o diafragma com uma tesoura e exponha o coração após fazer uma pequena incisão na veia porta com tesoura oftálmica, insira um cateter plástico de dois milímetros na veia e aperte a rosca firmemente ao redor do cateter.

Carregue um sistema de perfusão com a solução de lavagem pré-quente e conecte-o ao cateter. Comece a perfusão em C dois a uma taxa de 10 mililitros por minuto. Ao mesmo tempo, faça um corte na parede direita do átrio com uma tesoura de dissecação.

Continue a profusão por 10 minutos, depois troque a solução de profusão para a solução de colagenase e perfunda por 10 a 20 minutos. A uma taxa de 10 mililitros por minuto, encha um béquer estéril com 25 mililitros de solução de colagenase. Em seguida, retire e coloque cuidadosamente o fígado perfundido no copo.

Pique o fígado em pedaços pequenos com uma tesoura. Adicione 75 mililitros de MEM frio na suspensão celular resultante. Após uma pipetagem suave, filtre a suspensão através de um filtro de células de 100 micrômetros.

Para remover o tecido conjuntivo dos fragmentos de tecido não digeridos, recolher o filtrado em tubos cónicos de 50 mililitros. Transfira o filtrado para tubos cônicos de 50 mililitros e lave as células quatro vezes, primeiro girando as células a 50 Gs por um minuto a quatro graus Celsius. Com a interrupção, rejeitar cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, ressuspender o sedimento em MEM frio e centrifugar novamente as células após a última lavagem.

Ressuspenda as células do fígado em meio de crescimento. Agora semeie as células em frascos de cultura de tecidos de cinco a 10 T 75 a uma densidade de 6,7 vezes 10 elevado a quarto por centímetro quadrado. Coloque os frascos de cultura em uma incubadora e substitua o meio de crescimento a cada dois ou três dias.

Após um dia de cultivo, os hepatócitos parenquimatosos se espalham na superfície do frasco e mostram morfologia poligonal típica de copal com um ou dois núcleos redondos. Poucos dias após a cultura, os hepatócitos parenquimatosos perdem sua morfologia de células epiteliais e se transformam em células fibroblásticas mais achatadas Por volta do sexto dia, contraste de fase, células semelhantes a macrófagos redondos brilhantes começam a proliferar na folha de células fibroblásticas. O crescimento das células semelhantes a macrófagos atinge níveis máximos por volta do dia 12.

O número de células semelhantes a macrófagos diminui por volta do dia 19, quando a folha de células fibroblásticas começa a degenerar. Assim, por volta de sete a 10 dias de cultura, suspendemos os macrófagos que proliferaram na folha celular no meio de cultura por agitação recíproca dos frascos de cultura por 30 minutos após os macrófagos terem sido ressuspensos. Toque cada um dos pratos de plástico sem cultura de tecidos de 100 milímetros com o meio de dois frascos T 75.

Reabasteça os frascos de cultura com meio de cultura e devolva-os à incubadora. Incube os pratos de plástico por 30 minutos após o período de incubação, lave os pratos três vezes aspirando o meio e enxaguando suavemente o prato de plástico com PBS, como visto aqui, 10 minutos após o revestimento de células semelhantes a macrófagos presas à superfície do prato, enquanto outras células fibroblásticas contaminantes permanecem suspensas. Após o enxágue do PBS, obtém-se uma população de macrófagos altamente purificada.

Como visto nesta figura, as células ganham morfologia típica de macrófagos após 40 minutos de cultivo e as células mitóticas são frequentemente observadas conforme indicado pelas setas. Para coletar esta nova população de macrófagos altamente purificada em um mililitro de solução LE Express para as células lavadas e coloque os pratos de volta na incubadora por mais 10 minutos. Após este período de incubação, adicione nove mililitros de meio de crescimento e, em seguida, raspe suavemente os macrófagos anexados com o raspador de células e transfira para uma centrífuga de tubo cônico de 15 mililitros e descarte o sobrenadante.

Adicionar um mililitro do meio de crescimento, dissociar os aglomerados de células ressuspensas em células isoladas por pipetagem vigorosa, enumerar o número de células por hemocitómetro como indicado neste gráfico, mais de 10 das seis células podem ser colhidas de um frasco de cultura T 75 repetidamente em intervalos de dois a três dias durante mais de duas semanas, permitindo um rendimento celular total de 10 elevado a sete por balão de cultura T 75. Como mostrado nessas imagens, as células isoladas são imunocoradas com anticorpos monoclonais contra antígenos de macrófagos de rato, como CD 68 ou ED one e CD 1 72 A ou OX 41. Essas células possuíam propriedades funcionais de macrófagos, como fagocitose ativa de microesferas marcadas com FITC.

Neste vídeo, apresentamos um método simples e eficiente para obter macrófagos a partir de culturas primárias mistas de hemácias hepáticas adultas. Nosso procedimento não requer equipamentos ou habilidades complexas, mas fornece um número suficiente de macrófagos puros que podem ser colhidos repetidamente da mesma cultura de latão. Este método pode ser aplicado a outras espécies de mamíferos.

Obrigado por assistir ao vídeo e boa sorte em seus experimentos futuros. Obrigada.