Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

O objetivo geral do experimento a seguir é obter múltiplas culturas de macrófagos a partir de culturas primárias mistas de células de fígado de rato, sem a necessidade de equipamentos complexos ou habilidades especializadas. Isso é alcançado inicialmente por meio da dissociação de células hepáticas de rato adulto por perfusão com colagenase, seguida pelo isolamento da fração celular de hepatócitos parenquimatosos. Em seguida, as células são incubadas em frascos de cultura de tecidos T 75 com meio de crescimento para estabelecer culturas primárias mistas de células hepáticas.

Então, após 10 a 12 dias de cultivo, os frascos de cultura são agitados para facilitar a transferência dos macrófagos para placas de plástico, de onde são posteriormente colhidos por adesão seletiva após um breve período de incubação. Por fim, mais de 10 das seis células podem ser colhidas repetidamente dos mesmos frascos de cultivo de tecidos T 75 em intervalos de dois a três dias por mais de duas semanas. Os métodos de isolamento de macrófagos hepáticos já foram bem descritos.

No entanto, a maioria dos métodos anteriores exige equipamentos sofisticados, como um ilustrador centrífugo, e habilidades técnicas refinadas. Aqui apresentamos um método simples e inovador para obter macrófagos hepáticos em número e pureza suficientes a partir de culturas primárias mistas de células hepáticas adultas envoltas, que não requer equipamentos especiais nem habilidades laboratoriais avançadas. A dissecação animal, a perfusão do fígado e o preparo dos citos serão demonstrados pelos doutores Norco, Yamanaka e Miko Yoshioka no Instituto Nacional de Saúde Animal.

Em seguida, o isolamento e a purificação de macrófagos hepáticos a partir de riscos culturais serão demonstrados pelo Dr. Taketo Takeno no Instituto Nacional de Ciências Agrobiológicas. Vamos começar. Para se preparar para a perfusão do fígado de rato, inicie pré-aquecendo uma garrafa de solução de lavagem e uma garrafa de solução de colagenase.

Em seguida, após confirmar a sedação por meio de pinçamento na pele, posicione uma rata macho adulta anestesiada em uma bandeja de aço inoxidável e pulverize etanol 70% sobre seu abdômen e tórax. A seguir, faça um pequeno corte no meio do abdômen com tesoura de dissecação e puxe a pele para trás. Então, abra o abdômen com a tesoura e confirme a localização da veia porta.

Em seguida, passe o fio cirúrgico sob a veia porta e aperte-o levemente. Depois, prenda a parte distal da veia cava inferior e da veia mesentérica com uma pinça hemostática fina para impedir o refluxo sanguíneo para o fígado. Abra a cavidade torácica cortando o diafragma com uma tesoura e exponha o coração; após fazer uma pequena incisão na veia porta com tesoura oftálmica, insira um cateter plástico de dois milímetros na veia e aperte firmemente o fio ao redor do cateter.

Carregue um sistema de perfusão com a solução de lavagem pré-aquecida e, em seguida, conecte-o ao cateter. Inicie a perfusão em C dois a uma taxa de 10 mililitros por minuto. Ao mesmo tempo, faça um corte na parede do átrio direito com tesoura de dissecação.

Continue a perfusão por 10 minutos, depois mude a solução de perfusão para a solução de colagenase e perfunda por 10 a 20 minutos. À taxa de 10 mililitros por minuto, encha um béquer estéril com 25 mililitros de solução de colagenase. Em seguida, remova e coloque cuidadosamente o fígado perfundido no béquer.

Pique o fígado em pequenos pedaços com tesoura. Adicione 75 mililitros de MEM frio à suspensão celular resultante. Após pipetagem suave, filtre a suspensão através de um filtro celular de 100 micrômetros.

Para remover o tecido conjuntivo nos fragmentos de tecido não digeridos, colete o filtrado em tubos cónicos de 50 mililitros. Transfira o filtrado para tubos cónicos de 50 mililitros e lave as células quatro vezes, primeiramente centrifugando as células a 50 Gs durante um minuto a quatro graus Celsius. Com a frenagem desativada, descarte cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o pellet em MEM frio e centrifugue as células novamente após a última lavagem.

Resuspenda as células hepáticas no meio de crescimento. Em seguida, semeie as células em cinco a dez frascos de cultura de tecidos T 75 numa densidade de 6,7 × 10⁴ células por centímetro quadrado. Coloque os frascos de cultura em uma incubadora e substitua o meio de crescimento a cada dois ou três dias.

Após um dia de cultivo, os hepatócitos parenquimatosos espalham-se pela superfície do frasco e apresentam morfologia típica poligonal, semelhante a pedras lajeadas, com um ou dois núcleos redondos. Em poucos dias de cultivo, os hepatócitos parenquimatosos perdem sua morfologia de célula epitelial e se transformam em células fibroblásticas mais achatadas. Por volta do sexto dia, células brilhantes e redondas, semelhantes a macrófagos, começam a proliferar sobre a camada de células fibroblásticas. O crescimento dessas células semelhantes a macrófagos atinge níveis máximos por volta do dia 12.

O número de células semelhantes a macrófagos diminui por volta do dia 19, quando a lâmina de células fibroblásticas começa a se degenerar. Assim, por volta de sete a dez dias de cultivo, suspendemos os macrófagos que proliferaram na lâmina celular no meio de cultura mediante agitação recíproca dos frascos de cultura durante 30 minutos após a ressuspensão dos macrófagos. Distribua o meio de dois frascos T75 em cada uma das placas plásticas não destinadas à cultura de tecidos de 100 milímetros.

Reabasteça os frascos de cultura com meio de crescimento e devolva-os ao incubador. Incube as placas de plástico por 30 minutos após o período de incubação, lave as placas três vezes aspirando o meio e enxaguando suavemente a placa de plástico com PBS, como visto aqui, já aos 10 minutos após o plaqueamento, células semelhantes a macrófagos aderidas à superfície da placa, enquanto outras células fibroblásticas contaminantes permanecem em suspensão. Após a lavagem com PBS, obtém-se uma população altamente purificada de macrófagos.

Como visto nesta figura, as células adquirem morfologia típica de macrófagos após 40 minutos de cultivo, e células em mitose são frequentemente observadas, conforme indicado pelas setas. Para coletar esta nova população altamente purificada de macrófagos, adicione um mililitro da solução trip LE Express às células lavadas e coloque as placas de volta no incubador por mais 10 minutos. Após este período de incubação, adicione nove mililitros de meio de crescimento e, em seguida, desprenda suavemente os macrófagos aderidos com a espátula celular, transfira para um tubo cônico de 15 mililitros, centrifugue e descarte o sobrenadante.

Adicione um mililitro do meio de crescimento, dissocie os agregados celulares re-suspensos em células individuais por pipetagem vigorosa, conte o número de células utilizando um hemocitômetro conforme mostrado neste gráfico, mais de 10 das seis células podem ser colhidas de um frasco de cultura T 75 repetidamente em intervalos de dois a três dias por mais de duas semanas, possibilitando um rendimento celular total de 10 elevado a sete por frasco de cultura T 75. Conforme mostrado nestas imagens, as células isoladas são imunomarcadas com anticorpos monoclonais contra antígenos de macrófagos de rato, como CD 68 ou ED um e CD 1 72 A ou OX 41. Essas células possuem propriedades funcionais de macrófagos, como a fagocitose ativa de microesferas marcadas com FITC.

Neste vídeo, apresentamos um método simples e eficiente para obter macrófagos a partir de culturas primárias mistas de células hepáticas vermelhas adultas. Nosso procedimento não exige equipamentos ou habilidades complexas, mas fornece quantidades suficientes de macrófagos puros que podem ser coletados repetidamente da mesma cultura de fígado. Este método pode ser aplicado a outras espécies de mamíferos.

Obrigado por assistir ao vídeo e boa sorte em seus experimentos futuros. Saúde.