Name: Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Aprenda a realizar hibridização in situ em montagem total para visualizar padrões de expressão gênica em embriões de camundongo E8.5-E11.5. Este protocolo robusto auxilia pesquisadores em biologia do desenvolvimento.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios do NIH R21MH082360 (BGC) e R01HD056315 (NRM), bem como pela University of Georgia.

<ol><li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues%3A+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li>
<li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li>
<li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pax%5Bzf-a%5D%3A+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis%2FTWis+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li>
<li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li>
<li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li>
<li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo%3A+gene+expression+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li>
<li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis%2C+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

Os métodos descritos neste protocolo foram adaptados de diversas fontes e otimizados para embriões de camundongo inteiros com idade entre E8,5 e E11,5. Os métodos para hibridização in situ em preparações inteiras de embriões de vertebrados surgiram pela primeira vez no início da década de 1990 2,5-12. Este protocolo foi adaptado principalmente a partir de métodos desenvolvidos para embriões de Xenopus 7,8, bem como para camundongos 2,11. Em nosso protocolo, grande ênfase é dada à...

<table><tbody><tr><td>Trifosfato de digoxigenina-11-uridina-5&amp;rsquo;</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de trifosfatos de ribonucleosídeos</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11277057001</td><td></td></tr><tr><td>Colunas Quick Spin para purificação de RNA radiomarcado</td><td>Insumo</td><td>Roche Group</td><td>11274015001</td><td></td></tr><tr><td>Polimerase de RNA T7</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Polimerase de RNA SP6</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>10810274001</td><td></td></tr><tr><td>Polimerase de RNA T3</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>CTP, [&amp;#945;-32P] - 800 Ci/mmol, 10 mCi/mL, 250 &amp;mu;Ci</td><td>Reagente</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008X250UC</td><td></td></tr><tr><td>DNase I recombinante, livre de RNase</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Uréia, cristais incolores a brancos ou pó cristalino</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP169-500</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de carregamento para gel</td><td>Reagente</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-N+, Amersham</td><td>Insumo</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN82B</td><td></td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Equipamento</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietila</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Reagente</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio a 30% em água</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633-500</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído, grau EM, 8%</td><td>Reagente</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0/710</td><td>Usar com cautela conforme as instruções do fabricante&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Reagente bloqueador</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11096176001</td><td>Preparar solução estoque a 5% e armazenar a -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Protease K</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>3115852001</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A </td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>10109142001</td><td>Preparar solução estoque a 10 mg/mL e armazenar a -20&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Rnase T1</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>10109193001</td><td></td></tr><tr><td>Formamida ultrapura</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol hidrocloreto</td><td>Reagente</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155228</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ribonucleico de levedura torula, Tipo VI</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6625</td><td>extraído várias vezes com fenol/clorofórmio e precipitado, ressuspenso em H2O tratada com DEPC e armazenado a -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Fragments Fab anti-digoxigenina-AP</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Substrato BM Purple AP, precipitante. Solução pronta para uso.</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11 442 074 001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de conveniência para frascos de armazenamento, 4 mL, transparentes, com tampa fechada</td><td>Insumo</td><td>National Scientific Company</td><td>B7800-2</td><td></td></tr><tr><td>Forno de hibridização Shake N Bake</td><td>Equipamento</td><td>Boekel Scientific</td><td>136400</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Sure-Tek</td><td>Insumo </td><td>Fisher Scientific</td><td>15-200-402C</td><td></td></tr><tr><td>Meio de inclusão de tecidos Paraplast Plus</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td>Moldes plásticos descartáveis Peel-A-Way para inclusão de tecidos</td><td>Insumo</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18646A</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas microscópicas Colorfrost Plus</td><td>Insumo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-17</td><td></td></tr><tr><td>Vermelho Nuclear Rápido</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Reagente</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8310-16</td><td></td></tr></tbody></table>

monte todo in situ hibridação de e8.5 de embriões e11.5 rato

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

A hibridização in situ em preparação inteira é uma abordagem muito informativa para definir os padrões de expressão gênica em embriões. Os procedimentos de hibridização in situ são demorados e tecnicamente exigentes, com múltiplas etapas importantes que conjuntamente contribuem para a qualidade do resultado final. Este protocolo descreve em detalhes várias etapas-chave de controle de qualidade para otimizar a marcação e o desempenho da sonda. De modo geral, nosso protocolo fornece uma descrição detalhada das etapas críticas necessárias para obter resultados de alta qualidade de forma reprodutível. Primeiramente, descrevemos a geração de sondas de RNA marcadas com digoxigenina (DIG) por meio de transcrição in vitro de modelos de DNA gerados por PCR. Descrevemos três ensaios críticos de controle de qualidade para determinar a quantidade, a integridade e a atividade específica das sondas marcadas com DIG. Essas etapas são importantes para gerar uma sonda com sensibilidade suficiente para detectar RNAm endógenos em um embrião inteiro de camundongo. Além disso, descrevemos métodos para a fixação e o armazenamento de embriões de camundongo com idade entre E8,5 e E11,5 dias para hibridização in situ. Em seguida, descrevemos métodos detalhados para digestão limitada com proteinase K dos embriões reidratados, seguidos pelos detalhes das condições de hibridização, lavagens pós-hibridização e tratamento com RNase para remover a hibridização não específica da sonda. Um anticorpo conjugado à fosfatase alcalina (AP) é utilizado para visualizar a sonda marcada e revelar o padrão de expressão do transcrito endógeno. Resultados representativos são apresentados a partir de experimentos bem-sucedidos e de experimentos típicos subótimos.

Este protocolo de hibridização in situ em preparação inteira discute etapas críticas que garantem resultados de alta qualidade e reprodutíveis para estudos de expressão gênica em embriões de camundongo com idade entre E8,5 e E11,5 dias.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

A hibridização in situ em montagem total é uma abordagem muito informativa para definir padrões de expressão gênica em embriões. Os procedimentos de hibridização in situ ...

O objetivo geral deste procedimento é definir os padrões de expressão gênica em embriões inteiros de camundongo. Isso é realizado primeiramente projetando e gerando uma sonda ribonucleotídica específica para o gene de interesse. Em seguida, os embriões são coletados e tratados para hibridização.Em seguida, a sonda marcada é hibridizada aos embriões. O passo final consiste em visualizar a sonda hibridizada por detecção imunohistoquímica. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram os padrões de expressão gênica em embriões inteiros ou em cortes embriológicos.Após a aquisição de imagens com um estereomicroscópio, microscópio de dissecação ou microscópio de campo claro comum, geralmente os iniciantes nesse método enfrentam dificuldades, pois os procedimentos de hibridização in situ são demorados e tecnicamente exigentes, existindo várias etapas importantes que contribuem coletivamente para a qualidade do resultado final. Primeiro, gere o DNA molde amplificando a sequência de interesse usando iniciadores específicos para o gene projetados com sequências promotoras de transcrição T7, T3 ou SP6 nas extremidades 5'. Em seguida, purifique o produto de PCR e inclua um passo

whole-mount-in-situ-hybridization-of-e85-to-e115-mouse-embryos

Research

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Biologia

Este vídeo demonstra de 2 cores montar toda hibridização in situ, um método pelo qual o padrão de expressão espacial e temporal de 2 genes diferentes podem ser visualizados em embriões de galinha jovens. Este método foi originalmente introduzido por David Wilkinson, Henrique Domingos, Phil e David Ingham Ish-Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Nós demonstramos uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) para identificar as interações fator em tecido-específicos genes durante ou após o início da tecido-específicos de expressão gênica em camundongos tecido embrionário. Este protocolo deve ser amplamente aplicáveis ​​para o estudo do tecido-específicos ativação do gene como ocorre durante o desenvolvimento embrionário normal.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

Aqui vamos desenvolver as ferramentas necessárias...

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

Apresentamos aqui um protocolo otimizado para genotipar, corar e preparar fetos de camundongos para a imagem de projeções de axônios nociceptores periféricos em todo o animal, como um método eficaz para avaliar fenótipos de crescimento sensorial de axônios no desenvolvimento de camundongos geneticamente modificados.

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

Demonstramos um método para enxertar células cultivadas em locais definidos de embriões de camundongos iniciais para determinar seu potencial in vivo. Também introduzimos um método de eletroporação otimizado que usa capilares de vidro de diâmetro conhecido, permitindo a entrega precisa de DNA exógeno em algumas células dos embriões.

Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

Descrevemos um protocolo detalhado usando microscopia episcópica de alta resolução para adquirir imagens tridimensionais (3D) de embriões de camundongos. Este protocolo aprimorado utiliza um método de preparação de tecido modificado para aumentar a penetração do corante fluorescente, permitindo assim a análise morfométrica de espécimes pequenos e grandes.

Rápida aquisição de imagens 3D usando de alta resolução episc Microscopia

O nó e placa notochordal são transitórios de organizadores no desenvolvimento de embriões de rato que podem ser visualizados usando várias técnicas de sinalização. Aqui, descrevemos em detalhes como realizar duas das técnicas para estudar sua estrutura e morfogênese: 1) microscopia eletrônica (SEM); e 2) monte todo imunofluorescência (WMIF).

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

Apresentamos os protocolos para examinar o desenvolvimento de coração de rato usando microscopia epifluorescente de montagem toda em embriões de rato dissecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos. Este método nos permite visualizar diretamente a cada estágio da formação ventricular durante o desenvolvimento de coração de rato sem métodos histoquímicos trabalho intensivos.

Análise do desenvolvimento de câmara cardíaca durante a embriogênese de rato usando toda montagem de epifluorescência

Classicamente, o endocárdio do primordium da válvula embrionária de camundongo foi analisado usando cortes transversais, coronais ou sagitais. Nossa nova abordagem para imagens bidimensionais en face do endocárdio em regiões valvulogênicas permite a polaridade planar e a análise de rearranjo celular do endocárdio durante o desenvolvimento valvar.

En Face Preparação de Almofadas Endocárdicas para Análise de Morfogênese Planar em Embriões de Camundongos

Este artigo estabelece um pipeline para suspensões de células e núcleos únicos de alta qualidade de embriões de camundongos gastrulados para sequenciamento de células e núcleos únicos.

Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação

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Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

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