Name: Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Aprenda a realizar hibridização in situ em montagem total para visualizar padrões de expressão gênica em embriões de camundongo E8.5-E11.5. Este protocolo robusto auxilia pesquisadores em biologia do desenvolvimento.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios do NIH R21MH082360 (BGC) e R01HD056315 (NRM), bem como pela University of Georgia.

<ol><li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues%3A+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li>
<li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li>
<li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pax%5Bzf-a%5D%3A+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis%2FTWis+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li>
<li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li>
<li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li>
<li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo%3A+gene+expression+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li>
<li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis%2C+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

Os métodos descritos neste protocolo foram adaptados de diversas fontes e otimizados para embriões de camundongo inteiros com idade entre E8,5 e E11,5. Os métodos para hibridização in situ em preparações inteiras de embriões de vertebrados surgiram pela primeira vez no início da década de 1990 2,5-12. Este protocolo foi adaptado principalmente a partir de métodos desenvolvidos para embriões de Xenopus 7,8, bem como para camundongos 2,11. Em nosso protocolo, grande ênfase é dada à...

<table><tbody><tr><td>Trifosfato de digoxigenina-11-uridina-5&amp;rsquo;</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de trifosfatos de ribonucleosídeos</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11277057001</td><td></td></tr><tr><td>Colunas Quick Spin para purificação de RNA radiomarcado</td><td>Insumo</td><td>Roche Group</td><td>11274015001</td><td></td></tr><tr><td>Polimerase de RNA T7</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Polimerase de RNA SP6</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>10810274001</td><td></td></tr><tr><td>Polimerase de RNA T3</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>CTP, [&amp;#945;-32P] - 800 Ci/mmol, 10 mCi/mL, 250 &amp;mu;Ci</td><td>Reagente</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008X250UC</td><td></td></tr><tr><td>DNase I recombinante, livre de RNase</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Uréia, cristais incolores a brancos ou pó cristalino</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP169-500</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de carregamento para gel</td><td>Reagente</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-N+, Amersham</td><td>Insumo</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN82B</td><td></td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Equipamento</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietila</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Reagente</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio a 30% em água</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633-500</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído, grau EM, 8%</td><td>Reagente</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0/710</td><td>Usar com cautela conforme as instruções do fabricante&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Reagente bloqueador</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11096176001</td><td>Preparar solução estoque a 5% e armazenar a -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Protease K</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>3115852001</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A </td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>10109142001</td><td>Preparar solução estoque a 10 mg/mL e armazenar a -20&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Rnase T1</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>10109193001</td><td></td></tr><tr><td>Formamida ultrapura</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol hidrocloreto</td><td>Reagente</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155228</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ribonucleico de levedura torula, Tipo VI</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6625</td><td>extraído várias vezes com fenol/clorofórmio e precipitado, ressuspenso em H2O tratada com DEPC e armazenado a -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Fragments Fab anti-digoxigenina-AP</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Substrato BM Purple AP, precipitante. Solução pronta para uso.</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11 442 074 001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de conveniência para frascos de armazenamento, 4 mL, transparentes, com tampa fechada</td><td>Insumo</td><td>National Scientific Company</td><td>B7800-2</td><td></td></tr><tr><td>Forno de hibridização Shake N Bake</td><td>Equipamento</td><td>Boekel Scientific</td><td>136400</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Sure-Tek</td><td>Insumo </td><td>Fisher Scientific</td><td>15-200-402C</td><td></td></tr><tr><td>Meio de inclusão de tecidos Paraplast Plus</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td>Moldes plásticos descartáveis Peel-A-Way para inclusão de tecidos</td><td>Insumo</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18646A</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas microscópicas Colorfrost Plus</td><td>Insumo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-17</td><td></td></tr><tr><td>Vermelho Nuclear Rápido</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Reagente</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8310-16</td><td></td></tr></tbody></table>

monte todo in situ hibridação de e8.5 de embriões e11.5 rato

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

A hibridização in situ em preparação inteira é uma abordagem muito informativa para definir os padrões de expressão gênica em embriões. Os procedimentos de hibridização in situ são demorados e tecnicamente exigentes, com múltiplas etapas importantes que conjuntamente contribuem para a qualidade do resultado final. Este protocolo descreve em detalhes várias etapas-chave de controle de qualidade para otimizar a marcação e o desempenho da sonda. De modo geral, nosso protocolo fornece uma descrição detalhada das etapas críticas necessárias para obter resultados de alta qualidade de forma reprodutível. Primeiramente, descrevemos a geração de sondas de RNA marcadas com digoxigenina (DIG) por meio de transcrição in vitro de modelos de DNA gerados por PCR. Descrevemos três ensaios críticos de controle de qualidade para determinar a quantidade, a integridade e a atividade específica das sondas marcadas com DIG. Essas etapas são importantes para gerar uma sonda com sensibilidade suficiente para detectar RNAm endógenos em um embrião inteiro de camundongo. Além disso, descrevemos métodos para a fixação e o armazenamento de embriões de camundongo com idade entre E8,5 e E11,5 dias para hibridização in situ. Em seguida, descrevemos métodos detalhados para digestão limitada com proteinase K dos embriões reidratados, seguidos pelos detalhes das condições de hibridização, lavagens pós-hibridização e tratamento com RNase para remover a hibridização não específica da sonda. Um anticorpo conjugado à fosfatase alcalina (AP) é utilizado para visualizar a sonda marcada e revelar o padrão de expressão do transcrito endógeno. Resultados representativos são apresentados a partir de experimentos bem-sucedidos e de experimentos típicos subótimos.

Este protocolo de hibridização in situ em preparação inteira discute etapas críticas que garantem resultados de alta qualidade e reprodutíveis para estudos de expressão gênica em embriões de camundongo com idade entre E8,5 e E11,5 dias.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

A hibridização in situ em montagem total é uma abordagem muito informativa para definir padrões de expressão gênica em embriões. Os procedimentos de hibridização in situ ...

O objetivo geral deste procedimento é definir os padrões de expressão gênica em embriões inteiros de camundongo. Isso é realizado primeiramente projetando e gerando uma sonda ribonucleotídica específica para o gene de interesse. Em seguida, os embriões são coletados e tratados para hibridização.Em seguida, a sonda marcada é hibridizada aos embriões. O passo final consiste em visualizar a sonda hibridizada por detecção imunohistoquímica. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram os padrões de expressão gênica em embriões inteiros ou em cortes embriológicos.Após a aquisição de imagens com um estereomicroscópio, microscópio de dissecação ou microscópio de campo claro comum, geralmente os iniciantes nesse método enfrentam dificuldades, pois os procedimentos de hibridização in situ são demorados e tecnicamente exigentes, existindo várias etapas importantes que contribuem coletivamente para a qualidade do resultado final. Primeiro, gere o DNA molde amplificando a sequência de interesse usando iniciadores específicos para o gene projetados com sequências promotoras de transcrição T7, T3 ou SP6 nas extremidades 5'. Em seguida, purifique o produto de PCR e inclua um passo de digestão com proteinase K de acordo com o protocolo descrito.Em seguida, monte uma reação de transcrição in vitro e incube na temperatura ideal por duas horas. Após a digestão do molde de DNA, purifique a sonda de RNA utilizando purificação por coluna e estime o rendimento da sonda usando um NanoDrop ou leitor de absorção em microplaca. Em seguida, ajuste a concentração da sonda para 100 nanogramas por microlitro de acordo com o rendimento estimado.Em seguida, verifique a qualidade da sonda por meio de eletroforese em gel desnaturante de acrilamida conforme descrito no protocolo escrito e pela medição da atividade específica da sonda RIBA; uma boa sonda deve apresentar uma única faixa distinta no gel, com mínima difusão. Para medir a atividade específica, realize diluições seriadas da sonda ribo para obter uma faixa de diluições de 10 elevado a menos dois até 10 elevado a menos cinco. Em seguida, pipete um microlitro de cada diluição em um pedaço de membrana High Bond N+ com diâmetro de 82 milímetros, juntamente com um microlitro de uma amostra de DNA não marcada como controle. Imediatamente após a hibridização, reticule o filtro em um reticulador de UV a 125 milijoules.Adicione 10 mililitros do reagente bloqueador a 1% em tampão TN 1x e incube em temperatura ambiente por 30 minutos após a conclusão do bloqueio. Remova a solução bloqueadora e lave o filtro por 15 minutos em temperatura ambiente com 10 mililitros de tampão TN 1x durante a lavagem da membrana. Prepare uma diluição de 1 para 5.000 do anticorpo anti-doxigenina em fragmento FAB em 10 mililitros de tampão TN 1x após a lavagem.Incube a membrana nesta solução por 30 minutos. Após a incubação, lave a membrana duas vezes, por 15 minutos cada, em 10 mililitros de tampão TN um vezes. Após a lavagem final, aspire a solução de lavagem da placa de Petri e substitua por cinco mililitros de substrato BM purple. Incube a membrana nesta solução por 30 minutos.Após 30 minutos, verifique a membrana quanto à presença de um sinal visível emitido pelo ponto correspondente à diluição de 10 elevado a menos quatro. Se o sinal for visível, interrompa a reação colorimétrica lavando com TE cinco vezes, duas vezes por cinco minutos cada. Se nenhum sinal for visível após 30 minutos, a sonda deve ser descartada.Colete embriões de camundongo em PBST gelado. Em seguida, separe os embriões de acordo com o genótipo em tubos de quatro mililitros com tampa de rosca contendo PBST. Fixe os embriões com 4%PARALDEHYDE em PBST, salvo indicação em contrário.Todos os passos de incubação e lavagem são realizados com soluções preenchidas até o nível inferior do gargalo do frasco, o que corresponde a cerca de quatro mililitros de volume. Deixe os embriões durante a noite a quatro graus Celsius após a fixação. Aspire o paraformaldeído 4% em PBST com uma pipeta de vidro tipo espaguete e substitua por PBST.Coloque o frasco no gelo por cinco minutos para lavar. Repita este processo para lavar o tecido pela segunda vez. Em seguida, aspire o PBST e desidrate os embriões progressivamente através de uma série de metanol em PBST até 100% de metanol.Observe que a ponta da pipeta é mantida no lado oposto do frasco para evitar danos aos embriões; se desejado, os embriões podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius em metanol a 100% por até oito meses ou talvez mais, até o uso. Transfira os embriões para uma placa, perfure o coração e a cabeça dos embriões E10,5 e mais velhos com uma faca de microdissecação enquanto os embriões ainda estiverem em metanol. Isso permite que as soluções de lavagem penetrem nos ventrículos cerebrais e nas câmaras cardíacas e reduz a coloração de fundo.Em seguida, reidrate os embriões com lavagens sucessivas em uma série de metanol em PBST. Termine com duas lavagens de cinco minutos cada em PBST a 100%, branqueando os embriões mediante a preparação de uma solução de quatro partes de PBST para uma parte de peróxido de hidrogênio a 30% e incubando os embriões nesta solução por uma hora em gelo. Durante a incubação, coloque o tampão de hibridização recém-preparado a 65 graus Celsius para pré-aquecimento.Lave os embriões com PBST duas vezes, durante cinco minutos cada. Durante a lavagem final, prepare um estoque de proteinase K a 20 miligramas por mililitro com água DEPC. Em seguida, dilua o estoque em série para obter 10 microgramas por mililitro.Protease K em PBST aspire a solução final de lavagem e substitua por um mililitro da solução de protease K a 10 microgramas por mililitro. Coloque o frasco verticalmente em um suporte para tubos dentro de um banho-maria a 25 graus Celsius e incube por 10 a 30 minutos, dependendo do tamanho dos embriões. Anote o horário de início como sendo ideal e passível de replicação.O tempo de incubação é crítico para permitir a penetração da sonda de ribonucleotídeo sem uma superdigestão do embrião. Para interromper a digestão com protease K, aspire a solução de proteinase K trinta segundos antes do término do tempo de incubação. Em seguida, quando o tempo de incubação terminar, adicione glicina recém-preparada a dois miligramas por mililitro em PBST.Fique em repouso por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, repita a lavagem com glicina por mais cinco minutos. Depois, lave duas vezes em PBST por cinco minutos cada.A seguir, refixe os embriões tratados com proteinase K imergindo-os em PARAldedído 4% em PBST suplementado com glutaraldeído 0,2% por 20 minutos. Em seguida, lave os embriões em PBST três vezes, por cinco minutos cada. Após a última lavagem, aspire o PBST e substitua por um mililitro de tampão de hibridização pré-aquecido.Uma vez que os embriões tenham sedimentado, aspire o tampão de hibridização e substitua por um mililitro de tampão de hibridização pré-aquecido e fresco. Incube os tubos verticalmente em uma estufa a 65 graus Celsius com plataforma agitadora durante uma hora. Prepare o tampão de hibridização contendo 0,5 microgramas por mililitro de ribo marcado.Utilize sonda para embriões até E 8,5 ou de 0,1 a um micrograma por mililitro de sonda para embriões após E 8,5. Após a incubação, substitua a solução de pré-hibridização por 0,4 mililitros desta solução e hibridize durante a noite a 65 graus Celsius. No dia seguinte, verifique a qualidade dos embriões.Se os embriões tiverem sido submetidos a um tratamento excessivo com proteinase K, podem aderir ao tamanho do frasco, apresentar-se extremamente transparentes ou se desfazer. Embriões com essa aparência devem ser descartados, pois processá-los adicionalmente não resultará em dados interpretáveis. Substitua o tampão de hibridização por quatro mililitros de solução.Uma a 70 graus Celsius. Mantenha essa temperatura e realize duas vezes por 30 minutos cada para embriões E 8,5 ou três vezes por 30 minutos por lavagem. Para embriões E 9,5 e mais velhos, durante a última lavagem, prepare quatro mililitros de solução a 50%, uma solução a 50% duas para cada frasco e pré-aqueça a 70 graus Celsius após a última lavagem.Incube os embriões nesta solução por 10 minutos, depois lave três vezes por cinco minutos cada lavagem com quatro mililitros de solução. Duas vezes à temperatura ambiente com agitação após a lavagem. Substitua a solução por solução fresca.Duas contendo 100 microgramas por mililitro de RNAs A e 100 unidades por mililitro de RNAs T, uma incuba a 37 graus Celsius duas vezes por 30 minutos por lavagem. Em seguida, solução de lavagem três a 65 graus Celsius com agitação duas vezes por 30 minutos cada lavagem para E 8,5, três vezes por 30 minutos por lavagem para E 9,5 e mais velhos. Finalmente, lavar três vezes por cinco minutos por lavagem com uma vez TBST.Em seguida, prossiga para a detecção de anticorpos. Aspire a lavagem final com TBST do frasco e substitua por 0,5 mililitros de TBST 1x mais 10% de soro de carneiro tratado pelo calor. Coloque o frasco verticalmente sobre um agitador rotativo à temperatura ambiente e incube com movimento oscilante por pelo menos duas horas e meia para bloquear os sítios de ligação não específicos de anticorpos. Após o tempo de incubação, aspire a solução bloqueadora e substitua por uma solução fresca de TBST 1× contendo soro a 10%, com uma diluição de um para 2.000 a um para 5.000 do anticorpo de fosfatase alcalina subtraída, conjugado com antígeno de ovelha e fragmentos FAB, e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Lave três vezes, durante cinco minutos cada, com TBST 1×. Em seguida, lave de cinco a seis vezes, durante uma hora cada, à temperatura ambiente e, finalmente, durante a noite a quatro graus Celsius para remover o excesso de anticorpo.No dia seguinte, lave os embriões duas vezes, durante 20 minutos por lavagem, com tampão de fosfatase alcalina recém-preparado. Este é um procedimento importante para reduzir o fundo.Substitua a última lavagem por um mililitro de substrato roxo AP de BM pré-aquecido. Incube à temperatura ambiente, protegido da luz, e observe periodicamente o sinal por meio de microscópio estereoscópico. Para mensageiro abundante.O RNA deve ser visível dentro de 15 minutos. Quando o sinal estiver claramente visível ou se a coloração de fundo começar a ser um problema, interrompa a reação lavando duas vezes por cinco minutos cada lavagem com PBST um vezes mais EDTA cinco milimolar, e capture imagens para documentar o padrão de coloração do embrião inteiro. Após isso, retorne os embriões para um frasco com substrato BM purple e incube por 16 a 24 horas à temperatura ambiente até que a superfície externa do embrião fique azul-escura, permitindo que a coloração penetre por todo o embrião.Em seguida, transfira os embriões para 4% parmal hide em PBST para refixar por várias horas ou durante a noite a quatro graus Celsius. Esta etapa final de fixação é crucial para a preservação de longo prazo do padrão de coloração. Por fim, prossiga para a inclusão em parafina e seccionamento de acordo com os procedimentos descritos no protocolo escrito para revelar esta coloração.Esta imagem mostra uma montagem com sucesso do buraco em C em hibridização de um embrião E 10,5 utilizando uma sonda ribo específica para gata três. Aqui há uma imagem mostrando um embrião E 11,5 que foi rotulado com sucesso com uma sonda ribo específica para Fox G um. Esta imagem mostra fundo elevado e sinal fraco de uma hibridização em C fracassada com uma sonda gata três parcialmente degradada, ilustrando a importância de realizar um controle cuidadoso da qualidade das sondas para garantir resultados de alta qualidade.Aqui está uma imagem de outro procedimento malsucedido. Neste caso, o procedimento foi realizado sem a punção da cabeça, resultando em um alto nível de marcação de fundo nos ventrículos, conforme indicado pelas cabeças de seta. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar uma hibridização in situ de alta qualidade para definir padrões de expressão gênica em embriões de camundongo, com detalhes espaciais e comparações temporais ou de genótipo.

whole-mount-in-situ-hybridization-of-e85-to-e115-mouse-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra de 2 cores montar toda hibridização in situ, um método pelo qual o padrão de expressão espacial e temporal de 2 genes diferentes podem ser visualizados em embriões de galinha jovens. Este método foi originalmente introduzido por David Wilkinson, Henrique Domingos, Phil e David Ingham Ish-Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Nós demonstramos uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) para identificar as interações fator em tecido-específicos genes durante ou após o início da tecido-específicos de expressão gênica em camundongos tecido embrionário. Este protocolo deve ser amplamente aplicáveis ​​para o estudo do tecido-específicos ativação do gene como ocorre durante o desenvolvimento embrionário normal.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

Aqui vamos desenvolver as ferramentas necessárias...

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

Apresentamos aqui um protocolo otimizado para genotipar, corar e preparar fetos de camundongos para a imagem de projeções de axônios nociceptores periféricos em todo o animal, como um método eficaz para avaliar fenótipos de crescimento sensorial de axônios no desenvolvimento de camundongos geneticamente modificados.

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

Demonstramos um método para enxertar células cultivadas em locais definidos de embriões de camundongos iniciais para determinar seu potencial in vivo. Também introduzimos um método de eletroporação otimizado que usa capilares de vidro de diâmetro conhecido, permitindo a entrega precisa de DNA exógeno em algumas células dos embriões.

Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

Descrevemos um protocolo detalhado usando microscopia episcópica de alta resolução para adquirir imagens tridimensionais (3D) de embriões de camundongos. Este protocolo aprimorado utiliza um método de preparação de tecido modificado para aumentar a penetração do corante fluorescente, permitindo assim a análise morfométrica de espécimes pequenos e grandes.

Rápida aquisição de imagens 3D usando de alta resolução episc Microscopia

O nó e placa notochordal são transitórios de organizadores no desenvolvimento de embriões de rato que podem ser visualizados usando várias técnicas de sinalização. Aqui, descrevemos em detalhes como realizar duas das técnicas para estudar sua estrutura e morfogênese: 1) microscopia eletrônica (SEM); e 2) monte todo imunofluorescência (WMIF).

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

Apresentamos os protocolos para examinar o desenvolvimento de coração de rato usando microscopia epifluorescente de montagem toda em embriões de rato dissecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos. Este método nos permite visualizar diretamente a cada estágio da formação ventricular durante o desenvolvimento de coração de rato sem métodos histoquímicos trabalho intensivos.

Análise do desenvolvimento de câmara cardíaca durante a embriogênese de rato usando toda montagem de epifluorescência

Classicamente, o endocárdio do primordium da válvula embrionária de camundongo foi analisado usando cortes transversais, coronais ou sagitais. Nossa nova abordagem para imagens bidimensionais en face do endocárdio em regiões valvulogênicas permite a polaridade planar e a análise de rearranjo celular do endocárdio durante o desenvolvimento valvar.

En Face Preparação de Almofadas Endocárdicas para Análise de Morfogênese Planar em Embriões de Camundongos

Este artigo estabelece um pipeline para suspensões de células e núcleos únicos de alta qualidade de embriões de camundongos gastrulados para sequenciamento de células e núcleos únicos.

Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação

Aprenda a realizar hibridização in situ em montagem total para visualizar padrões de expressão gênica em embriões de camundongo E8.5-E11.5. Este protocolo robusto auxilia pesquisadores em biologia do desenvolvimento.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

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