Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

O objetivo geral deste procedimento é definir padrões de expressão gênica em embriões inteiros de camundongos. Isso é feito primeiro projetando e gerando uma sonda ribo específica para o gene de interesse. Em seguida, os embriões são coletados e tratados para hibridização.

Em seguida, a sonda marcada é hibridizada com os embriões. A etapa final é visualizar a sonda hibridizada por detecção imuno-histoquímica. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram padrões de expressão gênica em embriões inteiros ou seções embrionárias.

Depois de obter imagens com um aparelho de som, microscópio de dissecação ou um microscópio de campo claro comum, geralmente os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque os procedimentos de hibridização do instituto são demorados e tecnicamente exigentes, existem várias etapas importantes que contribuem coletivamente para a qualidade do resultado final. Primeiro, gere DNA molde amplificando a sequência de interesse usando primers de PCR específicos de genes projetados com sequências promotoras de transcrição de farge nas cinco extremidades principais. Em seguida, purifique o produto de PCR e inclua uma etapa de digestão da proteinase K de acordo com o protocolo escrito.

Em seguida, configure uma reação de transcrição in vitro e a temperatura ideal da incubadora por duas horas. Após a digestão do molde de DNA pelo DNA, purifique a sonda ribo usando purificação em coluna, estime o rendimento da sonda usando um NanoDrop ou um leitor de absorção de microplacas. Em seguida, ajuste a concentração da sonda para 100 nanogramas por microlitro de acordo com o rendimento estimado.

Em seguida, verifique a qualidade da sonda desnaturando a eletroforese em gel de acrilamida conforme descrito no protocolo escrito e medindo a atividade específica da sonda RIBA, uma boa sonda deve produzir uma única banda discreta no gel com esfregaço mínimo para medir a atividade específica, realizar a diluição em série da sonda ribo para obter uma faixa de diluições de 10 a menos dois a 10 a menos cinco. Em seguida, pipete um microlitro de cada diluição em um pedaço de 82 milímetros de diâmetro de membrana n plus de alta ligação, junto com um microlitro de uma amostra de DNA não rotulada como controle. Reticule o filtro imediatamente em um reticulador UV a 125 milijoules após a reticulação.

Adicione 10 mililitros de reagente de bloqueio a 1% em um tampão TN de uma vez, incube a temperatura ambiente por 30 minutos após a conclusão do bloqueio. Remova a solução de bloqueio e lave o filtro por 15 minutos em temperatura ambiente em 10 mililitros de um vezes tampão TN enquanto lava a membrana. Prepare uma diluição de um a 5.000 de anti-doxigênio no fragmento FAB em 10 mililitros de tampão TN de uma vez após a lavagem.

Incube a membrana nesta solução por 30 minutos Após a incubação, lave a membrana duas vezes por 15 minutos cada em 10 mililitros de um vezes tampão TN. Após a lavagem final, aspire a solução de lavagem da placa de Petri e substitua por cinco mililitros de substrato roxo BM. Incube a membrana nesta solução por 30 minutos.

Decorridos 30 minutos, verificar a presença de um sinal visível emitido pela membrana do ponto correspondente à diluição de 10 a menos quatro. Se o sinal estiver visível, interrompa a reação de cor lavando com cinco vezes TE duas vezes por cinco minutos de cada vez. Se nenhum sinal for visível após 30 minutos, a sonda deve ser descartada.

Colete embriões de camundongos em PBST gelado. Em seguida, classifique os embriões de acordo com o genótipo em quatro arquivos com tampa de rosca de mililitro contendo PBST. Fixe os embriões com 4% de PARALDEÍDO em PBST, a menos que especificado de outra forma.

Todas as etapas de incubação e lavagem são feitas com soluções cheias até o nível inferior do gargalo do frasco, que tem cerca de quatro mililitros de volume. Deixe os embriões durante a noite a quatro graus Celsius após a fixação. Aspire o paraldeído a 4% em PBST com uma pipeta de massa de vidro e substitua por PBST.

Coloque o frasco sobre gelo por cinco minutos para lavar. Repita esse processo para lavar o lenço de papel pela segunda vez. Em seguida, aspire o PBST e desidrate os embriões passo a passo através de um metanol na série PBST em 100% de metanol.

Observe que a ponta da pipeta é mantida no lado oposto do frasco para evitar danos aos embriões, se desejado, os embriões podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius em 100% de metanol por até oito meses e talvez mais até o uso. Transfira os embriões para um prato, perfure o coração e a cabeça dos embriões E 10.5 e mais velhos com uma faca de microdissecação enquanto os embriões ainda estão em metanol. Isso permite que as soluções de lavagem entrem nos ventrículos cerebrais e nas câmaras cardíacas e reduz as manchas de fundo.

Em seguida, reidratar os embriões por lavagens sucessivas em um metanol da série PBST. Terminando com duas lavagens por cinco minutos cada em 100% PBST, branqueie os embriões preparando uma solução de quatro partes de PBST para uma parte de peróxido de hidrogênio a 30% e incubando os embriões nesta solução por uma hora no gelo. Durante a incubação, coloque o tampão de hibridização recém-preparado a 65 graus Celsius para pré-aquecer.

Lave os embriões com PBST duas vezes por cinco minutos cada. Durante a lavagem final, faça um caldo de proteinase K de 20 miligramas por mililitro com água DEPC. Em seguida, dilua o caldo em série para fazer 10 microgramas por mililitro.

A proteinase K em PBST aspira a solução de lavagem final e substitui por um mililitro da solução de proteinase K de 10 microgramas por mililitro. Coloque o frasco verticalmente em um suporte para tubos dentro de um banho-maria de 25 a graus Celsius e incube por 10 a 30 minutos, dependendo do tamanho dos embriões. Anote a hora de início como ideal e replicável.

O tempo de incubação é fundamental para permitir a penetração da sonda ribo sem digestão excessiva do embrião. Para interromper a digestão da protease K, aspirar a solução de proteinase K 30 segundos antes do tempo de incubação. Então, quando o tempo de incubação terminar, adicione dois miligramas por mililitro de glicina em PBST.

Vamos ficar por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, repita a lavagem com glicina por mais cinco minutos. Em seguida, lave duas vezes em PBST por cinco minutos cada.

Em seguida, refixe os embriões tratados com proteinase K imergindo os embriões em 4% de PARALDEÍDO em PBST suplementado com 0,2% de glutaraldeído por 20 minutos. Em seguida, lave os embriões em PBST três vezes por cinco minutos cada. Após a última lavagem, aspire o PBST e substitua por um mililitro de tampão de hibridização pré-quente.

Assim que os embriões se estabelecerem, aspire o tampão de hibridização e substitua por um mililitro de hibridização pré-quente fresca. Buffer. Incube os frascos verticalmente em um forno a 65 graus Celsius com uma plataforma agitável por uma hora. Prepare o tampão de hibridização contendo 0,5 microgramas por mililitro de ribo marcado.

Sonda para embriões até E 8,5 ou 0,1 a um micrograma por mililitro de sonda para embriões além de E 8,5. Após a incubação, substitua a solução de pré-hibridização por 0,4 mililitros desta solução e hibridize durante a noite a 65 graus Celsius. No dia seguinte, verifique a qualidade dos embriões.

Se os embriões tiverem sido tratados em excesso com proteinase K, eles podem grudar no tamanho do frasco, parecer extremamente transparentes ou desmoronar. Os embriões que aparecem dessa maneira devem ser descartados, pois processá-los posteriormente não resultará em dados interpretáveis. Substitua o tampão de hibridização por quatro mililitros de solução.

Um a 70 graus Celsius. Mantenha essa temperatura e duas vezes por 30 minutos cada para embriões E 8,5 ou três vezes por 30 minutos por lavagem. Para embriões E 9.5 e mais velhos durante a última lavagem, prepare quatro mililitros de solução a 50%, uma solução a 50% dois para cada frasco e pré-aqueça a 70 graus Celsius após a última lavagem.

Incube os embriões nesta solução por 10 minutos, depois lave três vezes por cinco minutos por lavagem com quatro mililitros de solução. Dois à temperatura ambiente com balanço após a lavagem. Substitua a solução por uma solução nova.

Dois contendo 100 microgramas por mililitro de RNAs A e 100 unidades por mililitro de RNAs T, um incubam a 37 graus Celsius duas vezes por 30 minutos por lavagem. Em seguida, solução de lavagem três a 65 graus Celsius com balanço duas vezes por 30 minutos cada lavagem para E 8.5, três vezes por 30 minutos por lavagem para E 9.5 e mais velhos. Finalmente, lave três vezes por cinco minutos por lavagem com uma vez TBST.

Em seguida, prossiga para a detecção de anticorpos. Aspire a lavagem final de TBST do frasco e substitua por 0,5 mililitros de uma vez TBST mais 10% de soro de ovelha tratado termicamente. Coloque o frasco verticalmente em um agitador de plataforma à temperatura ambiente e incube com balanço por pelo menos duas horas e meia para bloquear os locais de ligação de anticorpos não específicos.

Decorrido o tempo de incubação, aspirar a solução de bloqueio e substituí-la por um novo TBST mais 10% de soro contendo uma diluição de um a 2000 a um a 5.000 de fosfatase alcalina subtraída, antígeno conjugado de ovelha e anticorpo de fragmentos FAB e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Lave três vezes por cinco minutos cada com uma vez TBST. Em seguida, cinco a seis vezes por uma hora atingem a temperatura ambiente e, finalmente, durante a noite a quatro graus Celsius para remover o excesso de anticorpos.

No dia seguinte. Lave os embriões duas vezes por 20 minutos por lavagem com tampão de fosfatase alcalina recém-feito. Este é um procedimento importante para reduzir o histórico.

Substitua a última lavagem por um mililitro de substrato AP roxo BM pré-quente. Incube à temperatura ambiente enquanto estiver protegido da luz e observe o sinal periodicamente por meio do sinal do microscópio de dissecação. Para mensageiro abundante.

O RNA deve ser visível em 15 minutos. Quando o sinal for claramente visível ou se a coloração de fundo começar a ser um problema, interrompa a reação lavando duas vezes por cinco minutos por lavagem com uma vez PBST mais cinco imagens de captura EDTA milimolar para documentar o padrão de coloração de todo o embrião de montagem. Feito isso, retorne os embriões a um frasco de substrato roxo BM e incube por 16 a 24 horas em temperatura ambiente até que a superfície externa do embrião fique azul escura para permitir que a mancha penetre em todo o embrião.

Em seguida, transfira os embriões para couro de 4% em PBST para refixar por várias horas ou durante a noite a quatro graus Celsius. Esta etapa final de fixação é crucial para a preservação a longo prazo do padrão de coloração. Por fim, proceda à parafina, incorporação e seccionamento de acordo com os procedimentos descritos no protocolo escrito para revelar esta coloração.

Esta imagem mostra uma montagem de furo bem-sucedida na hibridização C dois de um embrião E 10.5 usando uma sonda ribo específica gata três. Aqui está uma imagem mostrando um embrião E 11.5 que foi marcado com sucesso com uma sonda Fox G one specific ribo. Esta imagem mostra alto fundo e sinal fraco de uma falha na hibridização C dois com uma sonda gata three parcialmente degradada, ilustrando a importância de realizar um controle de qualidade cuidadoso das sondas para garantir resultados de alta qualidade.

Aqui está uma imagem de outro procedimento malsucedido. Nesse caso, o procedimento foi realizado sem punção da cabeça, resultando em um alto nível de coloração de fundo nos ventrículos, conforme indicado pelas pontas das setas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar hibridização de Instituto de alta qualidade para definir padrões de expressão gênica em embriões de camundongos para detalhes espaciais e comparações temporais ou de genótipos.