Protein Assay Overlay membrana: um protocolo para testar Interação entre proteínas solúveis e insolúveis In vitro

Testando proteína. A interação proteica é indispensável para a dissecação da funcionalidade da proteína. Este vídeo apresenta um ensaio de ligação à proteína in vitro para testar a interação entre uma membrana e uma proteína imobilizada com uma proteína solúvel.

Primeiro, as proteínas de fusão são clonadas, expressas e extraídas. A proteína insolúvel marcada é imobilizada na membrana de nitrocelulose e tratada para ser redobrada até sua confirmação nativa. A membrana é então sondada com proteínas solúveis marcadas e o immunoblotting é realizado para detectar as proteínas.

Se as proteínas marcadas interagirem, elas serão capturadas pela proteína imobilizada na membrana, e o sinal do immunoblotting será observado. Assim, este ensaio fornece um método confiável para testar a interação entre uma proteína insolúvel e uma proteína em solução. A principal vantagem dessa técnica sobre os vasos existentes, como o GST pulldown, é que você pode avaliar com segurança a ligação entre a proteína insolúvel e a proteína solúvel in vitro.

O primeiro passo deste procedimento é gerar proteínas geneticamente marcadas para detecção. Comece clonando a proteína que será imobilizada na membrana. Refira-se aqui como pro Im para proteína imobilizada em um vetor de expressão, codificando uma etiqueta grande como GST, o vetor de expressão vazio, que codifica apenas para a etiqueta será usado como um controle negativo de proteína imobilizada e é referido como pro IM nc.

Em seguida, clone a proteína que será usada como sonda solúvel em um vetor de expressão, codificando uma tag diferente, como estreptococo dois. Isso será referido como prosol para proteína solúvel como um controle negativo, clone, uma proteína solúvel de controle negativo no mesmo vetor de expressão. Isso será referido como Prosol NC para controle negativo de proteína solúvel.

Em seguida, use um sistema de expressão de proteínas, como um vírus coli ou balo, para expressar as proteínas marcadas que o sistema de expressão usado deve ser cuidadosamente escolhido com base na necessidade de modificações pós-tradução. Extrair as proteínas expressas do organismo de sua escolha. Para pro IM e pro I mnc Resus.

Suspenda as células no tampão de carregamento de página SDS contendo coquetel de inibidores de protease. Em seguida, ferva as células por cinco minutos e, em seguida, centrifugue-as para remover o precipitado para extrair Prosol e Prosol NC. Use procedimentos padrão. O pró-IMS pode ser extraído em condições de desnaturação, pois as proteínas serão redobradas após serem imobilizadas na membrana de nitrocelulose.

No entanto, o prosol deve ser extraído para dar uma confirmação nativa porque eles serão adicionados ao tampão de ligação assim que as proteínas marcadas forem extraídas. Determine a concentração das proteínas recombinantes usando um método padrão, como o kit de ensaio de proteínas BioRad. Se o extrato bruto em vez de proteína purificada será usado para o ensaio.

Estime a concentração da proteína de interesse por densitometria de varredura da banda correspondente em um gel de poliacrilamida SDS corado com kumasi. Usando concentrações conhecidas de BSA como referência. Em seguida, traçar a curva padrão com base nas intensidades de sinal medidas pela densitometria de varredura da BSA e calcular a quantidade de proteína contida no extrato bruto.

O próximo passo do procedimento é imobilizar pro Iam e pro IAM NC na membrana. Comece por colocar um micrograma, cada um dos extratos pro Iam e pro IAM NC em duplicado num gel de poliacrilamida SDS. Após a eletroforese, remova o gel das placas de vidro e coloque-o em 100 mililitros de tampão de transferência, depois incube com agitação suave por 20 minutos em temperatura ambiente.

Após a incubação, execute um western blot para transferir as proteínas para uma membrana de nitrocelulose após a transferência para permitir que as proteínas ligadas à membrana se dobrem novamente. Coloque a membrana em 15 mililitros de tampão A e incube-a com agitação suave. Para remover o SDS residual, incube por 15 minutos em temperatura ambiente com agitação suave.

Após a incubação, remova cuidadosamente a membrana do tampão. Em seguida, coloque a membrana em 25 mililitros de tampão de desnaturação. Incubar durante duas horas à temperatura ambiente com agitação suave.

Durante a incubação, a membrana de nitrocelulose ficará opaca. Em seguida, usando uma pinça, transfira a membrana para 25 mililitros de TBS e incube com agitação suave por cinco minutos. Durante esta etapa, a membrana retorna à sua cor branca original.

Em seguida, transfira a membrana para 25 mililitros de tampão de ligação. Incube a quatro graus Celsius com agitação suave durante a noite. Em seguida, a proteína solúvel será usada para sondar a membrana em busca da proteína imobilizada.

Primeiro, prepare os tampões de hibridização diluídos de um a 10 microgramas de prosol e prosol NC em tubos separados contendo 10 mililitros de tampão de ligação fresco. Em seguida, transfira o buffer para um saco de hibridização. Em seguida, corte a membrana em duas tiras, ambas contendo pro IM e pro IAM nc.

Essas membranas serão colocadas no tampão de hibridização. Transfira cada membrana para o prosol ou solução de hibridização NC prosol e incube por 1,5 horas em temperatura ambiente com agitação suave. Remova as membranas das soluções de hibridização e enxágue três vezes por 15 minutos em TBS.

Para visualizar as interações proteína-proteína, bloqueie a membrana com 2,5% de leite desnatado em TBST por uma hora. Após a incubação, coloque as membranas bloqueadas na solução primária de anticorpos. Aqui, o anticorpo policlonal de coelho antis estreptococos dois é usado.

Incubar durante uma hora à temperatura ambiente com agitação suave após a incubação. Enxágue as membranas em 20 mililitros de TBST por 15 minutos e duas vezes por cinco minutos em temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, coloque as membranas na solução de anticorpo secundário conjugado HRP Aqui, um anticorpo IgG anti-coelho conjugado ao HRP é usado.

Incubar durante uma hora à temperatura ambiente com agitação suave. Enxágue as membranas em 20 mililitros de TBST por 15 minutos e duas vezes por cinco minutos em temperatura ambiente com agitação suave como antes, após o enxágue final em TBS, visualize a interação proteína-proteína usando um substrato quimioluminescente HRP Aqui Millipore. Im Molan Ocidental Quimioluminescente.

O substrato HRP é usado após immunoblotting do prosol. Enxágue a membrana e o TBST por 15 minutos e duas vezes por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, reteste as membranas com o anticorpo primário para que a etiqueta seja pro.

Sou seguido pelo anticorpo secundário apropriado. Visualize PRO I e pro Im NNC detectando quimioluminescência para validar a identidade das bandas obtidas no ensaio de sobreposição de membrana proteica. A interação entre as proteínas A e K e YFP e MP CYFP foi avaliada em células epidérmicas de tabaco usando o método descrito neste vídeo, conforme mostrado aqui.

Quando a complementação de fluorescência biomolecular foi avaliada, o sinal YFP forte foi reconstruído. Este sinal BFC se acumulou em Punta na periferia celular, que são diagnósticos de plasma de porque MP é uma proteína altamente insolúvel. Quando expresso em bactérias ou em plantas, o ensaio de sobreposição de membrana proteica foi adotado para validar essa interação.

Extratos proteicos in vitro contendo um micrograma de GST MP ou GST não fundido foram resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS seguida de eletrotransferência para uma membrana de nitrocelulose. Quando esses pro iams foram sondados com um strep nnk solúvel dois GST mp, mas não não não fundidos, o GST exibiu ligação. Além disso, quando o mesmo conjunto de pró-IMS foi sondado com um pró-sargímetro não relacionado nc IE Arabidopsis citoplasmático, NADH quinase marcada estreptococo dois, nenhuma ligação foi observada demonstrando ainda mais a especificidade da interação A NK MP Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de reabastecer as proteínas imobilizadas adequadamente seguindo o protocolo apresentado.