Enriquecimento de fosfopeptídeos à base de dióxido de titânio: um método para o isolamento seletivo de fosfopeptídeos da biblioteca de peptídeos

Os fosfopeptídeos são cadeias curtas de aminoácidos contendo resíduos de serina, treonina ou tirosina fosforilados. Para isolar fosfopeptídeos de uma mistura de peptídeos, comece colocando grânulos de dióxido de titânio em um tubo. Equilibre para condicionar os grânulos usando um tampão de ligação acidificado adequado contendo um agente de têmpera. Adicione a concentração desejada de mistura de peptídeos à pasta do grânulo.

Incube a mistura com agitação contínua para evitar que as contas se assentem. A condição ácida promove o grupo fosfato dos fosfopeptídeos a formar ligações coordenadas com grânulos de titânio. O agente de têmpera no tampão reduz qualquer ligação inespecífica de peptídeos não fosforilados aos grânulos, deixando-os na suspensão.

Centrifugue para peletizar as esferas ligadas a fosfopeptídeos, enquanto os peptídeos não fosforilados permanecem no sobrenadante. Descarte o sobrenadante. Transfira os grânulos ligados a fosfopeptídeos para uma coluna de filtro de rotação pré-montada. Centrifugue para remover o tampão de ligação e prender os grânulos conjugados com fosfopeptídeos.

Transfira o filtro para um tubo limpo e adicione uma solução contendo amônia. A amônia torna a suspensão básica, fazendo com que os fosfopeptídeos se soltem dos grânulos. Centrifugue o conjunto para eluir e coletar os fosfopeptídeos não ligados. Os grânulos de dióxido de titânio permanecem no cartucho do filtro. Seque os fosfopeptídeos para remover quaisquer vestígios de amônia.

Pré-condicione o dióxido de titânio com 500 microlitros de 100% ACN duas vezes. Em seguida, condicione o dióxido de titânio com 500 microlitros de tampão fosfato de sódio 0,2 M, pH 7, duas vezes. Por fim, use 300 microlitros de tampão de equilíbrio para lavar as contas três vezes. Adicione 400 microlitros de 50% de ACN, 0,1% de TFA ao tubo de baixa ligação a proteínas. Em seguida, adicione 84 microlitros de ácido lático.

Transfira os fosfopeptídeos ressuspensos para o tubo de baixa ligação às proteínas e incube-os à temperatura ambiente usando um rotador de ponta a ponta por 1 hora. Depois de peletar as contas, use 300 microlitros de tampão de equilíbrio para lavá-las duas vezes e girá-las. Com 300 microlitros de tampão de enxágue, enxágue as contas duas vezes. Em seguida, transfira-os para um filtro de rotação de 0,2 micrômetro.

Após a centrifugação, transfira a unidade de filtro para um tubo limpo de 1,5 mililitro de baixa ligação a proteínas e, com 200 microlitros de amônio a 0,9% em água, elua o conteúdo duas vezes. Depois de verificar o pH, concentre o eluído a vácuo até a secura durante a noite para evaporar a amônia.

• Phosphopeptides - Short strings of amino acids that contain phosphorylated residues.
• Titanium Dioxide Beads - Used to isolate phosphopeptides from a peptide mix.
• Peptide Mix - A mixture of peptides used in protein analysis and research.
• Phosphopeptide Enrichment Kits - Toolkits developed for isolating and enriching phosphopeptides.
• TFA Buffer - A solution used to stabilize pH, often used in biochemistry and molecular biology.

• Introduction to Phosphopeptides - Essential constituents in protein analysis and research (e.g., phosphopeptides).
• Usage of Titanium Dioxide Beads - They isolate phosphopeptides from a peptide mix (e.g., titanium phosphate).
• Role of Phosphopeptide Enrichment Kits - Helps isolate and enrich phosphopeptides (e.g., massprep phosphopeptide enrichment kits).
• Connection to Experiment – The process of isolating and enriching phosphopeptides is central to this study.

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• Description of Practical Applications – Isolating phosphopeptides has broad applications in protein analysis and research (e.g., peptide mix).
• Identification of Industry Impact – This process is beneficial in various sectors that heavily rely on biochemistry and molecular biology (e.g., healthcare).
• Highlighting Societal Importance – Having a deeper understanding of protein analysis and research paves the way for biological advancements (e.g., sustainability).
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