Name: Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Aprenda a técnica SISCAPA para quantificação de peptídeos usando enriquecimento imunoafinidade e espectrometria de massa. Este método automatizado permite análise multiplex rápida e custo-efetiva em pesquisa biológica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi financiado pela Clínica NCI Tecnologia Proteômica Assessment Center (CPTAC) conceder (# U24 CA126476), bem como uma concessão da indústria do entretenimento Foundation (FEI) eo Fundo das Mulheres FEI Pesquisa do Câncer da Mama Consórcio Descoberta Cancer Biomarker, e generosas doações da Fundação Keck, a Fundação Canárias e dos Paul G. Allen Família Foundation.

Procedimento experimental: O ensaio requer peptídeos sintéticos e anticorpos anti-peptídeo. Peptídeos selecionados deve ser exclusivo para a proteína de interesse, conter entre 8 e 22 aminoácidos, e não tem conhecido modificações pós-translacionais. Resíduos de metionina são geralmente evitada e peptídeos contendo aminoácidos dibásicos (por exemplo, KK, KR, RR) são indesejáveis. Para esta técnica, é comum o uso de peptídeos isótopo estável rotulados como normas internas, incorporando pesado (13 C e 15 N) marcado aminoácidos no C-terminal do peptídeo (ou seja, K ou R rotulados). O protocolo a seguir descreve um teste desenvolvido para medir a GDSLAYGLR peptídeo da proteína Osteopontina mouse, utilizando anticorpos anti-peptídeo obtido a partir de Epitomics Inc. (Burlingame, CA) e peptídeos sintéticos da Nova Inglaterra Peptide (Gardner, MA). O protocolo consiste em três etapas principais (Figura 1): 1) Tripsina digestão das proteínas complexas, 2) Enriquecimento de peptídeos 3) Análise por espectrometria de massa. Será demonstrado em uma amostra de plasma humano enriquecida com a proteína Osteopontina mouse. 1. Tripsina digestão enzimática e limpeza <ol><li> Thaw 10 mL alíquota plasma puro em gelo molhado. </li><li> Determinar a concentração de proteínas totais por ensaio BCA e centrifugar a amostra para remover quaisquer sólidos em suspensão. </li><li> Pipeta alíquota de 10 L de seu tubo de armazenamento para uma placa Deepwell 1000 mL e cubra com pierce-able filme. </li><li> Adicionar 20 mL de 9M fresco uréia / 30mm ditiotreitol (DTT) (final de concentração 6M TDT uréia / 20mm) para cada amostra. </li><li> Incubar por 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Adicionar 3 mL de iodoacetamida mM fresco 500 (IAM final de 50 mM) para cada amostra. </li><li> Incubar por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 257 mL de 100 mM Tris (pH 8) (dilui uréia para 0,6 M ~). </li><li> Adicionar 10 mL de tripsina solução estoque (1 mg / mL; para 01:50 enzima: substrato). </li><li> Incubar 37 ° C durante a noite (12-16 horas). </li><li> Adicionar 3 mL de ácido fórmico pura (concentração final de 1%). </li><li> Adicionar padrão de isótopos estáveis ​​(padrões múltiplos são adicionados se realizar um ensaio multiplex, geralmente essa é cerca de 10 mL contendo 5-10 fmol de peptídeo isotopicamente marcado standard). </li><li> Lavar a placa do cartucho Oasis bem com 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila 80%, descartando o escoamento. Repita 3 vezes. </li><li> Equilibrar a placa do cartucho, adicionando 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em água, e descartar o escoamento. Repita isso 4 vezes. </li><li> Carregar amostras digerir a placa do cartucho e ajustar o vácuo de modo que o fluxo é muito lento. </li><li> Lavar com 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em água, e descartar por escoamento. Repita 3 vezes. </li><li> Peptídeos eluir pela adição de 2 x 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila 80% em 1000 prato fundo bem-mL (não descartam a flow-through). </li><li> Lyophilize (ou speedvac) o eluído até à dessecação. (Liofilização é o método preferido) </li><li> Reconstituir secas peptídeos pela adição de 50 mL PBS + 0,03% CHAPS. </li></ol> 2. Peptídeo de enriquecimento de imunoafinidade <ol><li> Transferir a amostra a norma Kingfisher 96 placas bem. </li><li> Adicionar um anticorpo mg e 1,5 mL da proteína G-esferas magnéticas revestidas por alvo (que é opcional para crosslink o anticorpo para as contas antes disso). Garantir contas são bem suspenso por agitação ou vórtex. </li><li> Cobrir a placa com papel alumínio. </li><li> Incubar overnight (12-16 horas) com suave caindo para garantir contas são suspensas. </li><li> Centrífuga placa a 32 xg por 5 segundos para remover qualquer líquido a partir da superfície da folha. </li><li> Remova a cobertura de alumínio. </li><li> Lavagem e eluição das contas pode ser feita manualmente ou de forma automatizada. Este procedimento descreve as etapas automatizadas em uma plataforma de Kingfisher. </li><li> Lave as contas duas vezes com 200 mL PBS + 0,03% CHAPS (1 minuto por lavagem). </li><li> Lave as contas uma vez com 200 mL de diluição de 1:10 de PBS + CHAPS 0,03% (1 minuto). </li><li> Os peptídeos são eluídos em 25 uL de 5% de ácido acético + CHAPS 0,03%. </li><li> Coloque a placa de eluição em um ímã e transferir o eluato para um prato de 96 poços, tendo o cuidado de não transferir as contas sobra. </li><li> Cobrir a placa com um tapete de vedação. </li><li> A placa contendo o eluato é entregue ao espectrômetro de massas triplo quadrapole para análise. </li></ol> 3. Análise por monitoramento de reações múltiplas - espectrometria de massa <ol><li> Transições para SRM / MRM análise podem ser selecionados e otimizados pela infusão de uma solução picomole 1 por microlitro do padrão de peptídeos em 30% de ácido fórmico acetonitrile/0.1% para o espectrômetro de massa de 0,5 mL / min. Uma vez de spray estável é obtido, recolher um espectro de MS / MS. </li><li> Transições são selecionados a partir do espectro MS / MS, identificando three íons fragmento abundantes em uma região do espectro com pouco ruído. Para multiplicar-íons carregados peptídeo, os fragmentos y-ion detectado em m / z&gt; precursor m / z são normalmente o melhor para o SRM / MRM desenvolvimento ensaio. Figura 2 mostra o espectro de MS / MS e íons de transição selecionados 476,3&gt; 508,3, 579,3 , 692,4 (transições para o pesado isótopo estável padrão não 481,3&gt; 518,3, 589,3, 702,4 mostrado) para a GDSLAYGLR peptídeo. </li><li> Dependendo da marca e modelo do espectrômetro de massa utilizada, existem vários parâmetros que podem ser otimizados para cada transição. Aqui, nós otimizamos a energia de colisão de cada transição selecionados por ramping a energia da colisão e monitoramento do nível de sinal. A energia de colisão de 25 foi usado para cada transição. </li><li> Resumidamente, uma configuração típica para SRM / MRM análise é a seguinte: Fase móvel (A) ácido fórmico 0,1%, (B) acetonitrila 90% / 0,1% de ácido fórmico, 0,3 x 5 mm coluna armadilha C18, 75 mM ID x 15 cm coluna analítica C18 (Reprosil-Pur AQ C18, 120 A poros °). O volume de injeção é de 10 mL da amostra e é carregado por 5 min a B 3% a uma vazão total de 3 mL / min e eluída por um gradiente linear 3-45% B no 300-400 nL / min em 10 min. Condições em um QTRAP 4000 (ABSCIEX, Foster City, CA) foram spray de 2,3 kV de tensão, temperatura da fonte de íons de 150 ° C, GS1 de 12, e gás de cortina 15. </li><li> A amostra é analisada por SRM / MRM, injetando 10 mL da amostra. Áreas dos picos são integrados para peptídeos leves e pesados ​​usando o Skyline programa. 14 Calcule a razão da área de pico (PAR) do peptídeo unlabeled / rotulados em cada amostra usando a transição mais abundante que é livre de ruído de fundo, neste caso, a transição y5 (peptídeo luz 476,3&gt; 579,3, pesado peptídeo padrão 481,3&gt; 589,3). </li></ol> 4. Resultados representativos: Medida razões das áreas de pico (em relação peptídeo luz endógena para peptídeo pesados ​​spiked isotopicamente marcado) fornecer uma medida quantitativa do peptídeo alvo. Figura 3 mostra um exemplo de cromatograma peptídeos leves e pesados ​​em uma amostra SISCAPA enriquecido. Note-se que os peptídeos leves e pesados ​​eluir no mesmo tempo e várias transições podem ser monitorados para cada peptídeo para confirmar a identidade. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Panorama Um esquema do processo SISCAPA. Uma mistura de proteínas complexo é digerido em peptídeos. Analitos peptídeo alvo (analito endógenos e uma spiked isótopo estável com etiqueta padrão interno) são enriquecidos com anticorpos anti-peptídeo imobilizada em proteína G-revestido partículas magnéticas. Após isolamento, os peptídeos são alvo eluída as partículas magnéticas e analisados ​​por espectrometria de massa para quantificação em relação ao padrão interno. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. MS / MS espectro da GDSLAYGLR peptídeo mostrando seleção de três fragmentos de SRM / MRM transições. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Cromatogramas Exemplo mostrando o perfil de pico de um analito peptídeo de luz (vermelho) eo pesado isótopo estável com etiqueta padrão interno (azul). Cromatogramas para a transição y5 do peptídeo luz (476,3&gt; 579,3) e de isótopos estáveis ​​pesados ​​rotulados padrão (481,3&gt; 589,3) são plotados ao longo do tempo como eles saem da sistema de cromatografia.

<ol><li>Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+flaws+of+immunoassays+and+potential+solutions+using+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).</li>
<li>Anderson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+quantitation+of+peptides+and+proteins+using+Stable+Isotope+Standards+and+Capture+by+Anti-Peptide+Antibodies+%28SISCAPA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA).</a> J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).</li>
<li>Chace, D. H., Kalas, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+perspective+on+the+use+of+tandem+mass+spectrometry+for+newborn+screening+and+clinical+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing.</a> Clin Biochem. 38, 296-309 (2005).</li>
<li>Want, E. J., Cravatt, B. F., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+role+of+mass+spectrometry+in+metabolite+profiling+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization.</a> Chembiochem. 6, 1941-1951 (2005).</li>
<li>Barr, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+dilution--mass+spectrometric+quantification+of+specific+proteins%3A+model+application+with+apolipoprotein+A-I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Isotope dilution--mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I.</a> Clin Chem. 42, 1676-1682 (1996).</li>
<li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6940-6945 (2003).</li>
<li>Kuhn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+C-reactive+protein+in+the+serum+of+patients+with+rheumatoid+arthritis+using+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry+and+13C-labeled+peptide+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards.</a> Proteomics. 4, 1175-1186 (2004).</li>
<li>Whiteaker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+enrichment+of+peptides+on+magnetic+beads+for+mass-spectrometry-based+quantification+of+serum+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers.</a> Anal Biochem. 362, 44-54 (2007).</li>
<li>Hoofnagle, A. N., Becker, J. O., Wener, M. H., Heinecke, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+thyroglobulin%2C+a+low-abundance+serum+protein%2C+by+immunoaffinity+peptide+enrichment+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry.</a> Clin Chem. 54, 1796-1804 (2008).</li>
<li>Kuhn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+Multiplexed+Assays+for+Troponin+I+and+Interleukin-33+in+Plasma+by+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+and+Targeted+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry.</a> Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).</li>
<li>Whiteaker, J. R., Zhao, L., Anderson, L., Paulovich, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+and+multiplexed+method+for+high+throughput+peptide+immunoaffinity+enrichment+and+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry-based+quantification+of+protein+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9, 184-196 (2010).</li>
<li>Neubert, H., Gale, J., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+high-flow+peptide+immunoaffinity+enrichment+and+nanoflow+LC-MS%2FMS%3A+assay+development+for+total+salivary+pepsin%2Fpepsinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen.</a> Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).</li>
<li>Ackermann, B. L., Berna, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+immunoaffinity+techniques+with+MS+for+quantitative+analysis+of+low-abundance+protein+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers.</a> Expert Rev. Proteomics. 4, 175-186 (2007).</li>
<li>MacLean, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).</li>
<li>Proc, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+the+effects+of+chaotropic+agents%2C+surfactants%2C+and+solvents+on+the+digestion+efficiency+of+human+plasma+proteins+by+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin.</a> J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).</li>
<li>Berna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+immunoaffinity+liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry+determination+of+a+type+II+collagen+peptide+biomarker+in+rat+urine%3A+Investigation+of+the+impact+of+collision-induced+dissociation+fluctuation+on+peptide+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation.</a> Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O passo mais crítico no protocolo, conforme descrito é garantir as contas permanecem bem misturado durante o período de incubação. Permitindo que as contas para se depositar no fundo do poço / frasco irá resultar em aumento da variabilidade. Também é importante para spin-down qualquer líquido que possa permanecer no topo do poço / frasco após o período de incubação. Digestão com tripsina reprodutíveis também é crítica. O procedimento para a digestão descrita aqui tem sido utilizada extensivamente em nosso laboratório em conjunto com SISCAPA, no entanto, é provável que os métodos alternativos de digestão pode ser otimizado para um determinado conjunto de proteínas-alvo 15 eluição do anticorpo livre não interfere com a detecção do. peptídeo, provavelmente porque o anticorpo é excluído da coluna ou elui mais tarde do que os peptídeos, mas o anticorpo pode ser reticulado às esferas G Protein antes de afinidade em experiências de enriquecimento de grande ou se anticorpo livre se torna um problema. Temos também que era útil para colocar um ímã sob a placa de amostra no amostrador automático, bem como lavar a coluna armadilha na direção contrária do fluxo (em comparação com a carga) para remover todas as pérolas residual ou partículas. Além da abordagem magnética talão descrito, a técnica também pode ser adaptado para um formato de coluna (ou seja, cromatografia de afinidade). 12, 16 Quando o usuário está confortável com o protocolo geral, a técnica também é passível de várias modificações que melhoram o ensaio geral. 11 Primeiro, é possível analisar analitos múltiplos em um único ensaio, combinando anticorpos na etapa de enriquecimento (multiplexação por exemplo). O espectrômetro de massa é capaz de analisar simultaneamente um grande número de analitos. Segundo, aumentando o volume de amostra original melhora a sensibilidade do ensaio.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do material </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> 1000ul placas poço profundo de 96 poços </td><td> Eppendorf </td><td> 951032786 </td></tr><tr><td> Oasis HLB 1 cc placa do cartucho, Sep-pak, 40 mg placa de 96 poços </td><td> Águas </td><td> 186003966 </td></tr><tr><td> Kingfisher placa de 96 poços </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 97002540 </td></tr><tr><td> Claro de 96 poços, placa de parede branca </td><td> Bio-Rad </td><td> HSP9601 </td></tr><tr><td> Folha de cobertura para placa de 96 poços </td><td> Excelscientific </td><td> 12-169 </td></tr><tr><td> Axymat esteira de vedação para placa de 96 poços </td><td> Axygen </td><td> 521-01-151 </td></tr><tr><td> X furar filme </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z722502 </td></tr><tr><td> Kingfisher processador magnético talão com PCR cabeça ímã </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> HSP 9601 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Materiais <table border="1"><tbody><tr><th> Nome do material </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Uréia </td><td> Sigma Aldrich </td><td> U6031 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma base de </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitol (TDT) </td><td> Perfurar </td><td> 20291 </td><td> &quot;Não-pesar ditiotreitol&quot; </td></tr><tr><td> Iodoacetamida (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> I1149 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina Ouro </td><td> Promega </td><td> V5280 </td><td></td></tr><tr><td> Proteína G esferas magnéticas, 2.8um </td><td> Invitrogen </td><td> 10004D </td><td></td></tr><tr><td> Tampão fosfato (PBS) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> L5401 </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 28300 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido fórmico </td><td> EMD </td><td> 11670 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrila </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> A998-1 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 242853 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2: Reagentes <table border="1"><tbody><tr><th> Solução </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> 100 mM Tris pH 8 </td><td></td></tr><tr><td> 9 M de uréia / 30 mM DTT em 100 mM Tris (pH 8) </td><td> deve ser renovada a cada vez </td></tr><tr><td> IAM 500 mM em 100 mM Tris (pH 8) </td><td> deve ser renovada a cada vez </td></tr><tr><td> Tripsina 1mg/mL em 100 mM Tris pH 8 </td><td></td></tr><tr><td> Inibidor de tripsina 1mg/mL em 100 mM Tris pH 8 </td><td></td></tr><tr><td> Isótopo estável padrão Mastermix </td><td></td></tr><tr><td> Anti-peptídeo Mastermix anticorpos </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3: Soluções para estar preparado

quantificação de proteínas usando enriquecimento imunoafinidade peptide acoplado com espectrometria de massa

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Há uma grande necessidade de ensaios quantitativos para medir proteínas. Imunoensaios sanduíche tradicional, amplamente considerado o padrão ouro na quantificação, estão associados a um alto custo, longo tempo, e estão repletas de desvantagens (por exemplo, anticorpos heterofílicos, a interferência auto-anticorpos, &#39;gancho-efeito &quot;). Uma técnica Uma alternativa é o enriquecimento de afinidade de peptídeos acoplado com espectrometria de massa quantitativos, comumente referido como SISCAPA (Padrões de Isótopos Estáveis ​​e Captura de Anticorpos Anti-Peptide). 2 Nesta técnica, a afinidade de enriquecimento de peptídeos com a diluição de isótopos estáveis ​​e detecção de selecionados / múltiplos de reação monitoramento espectrometria de massa ( SRM / MRM-MS) fornece medição quantitativa de peptídeos como substitutos para suas respectivas proteínas. SRM / MRM-MS está bem estabelecido para a quantificação precisa de pequenas moléculas 3, 4 e mais recentemente foi adaptado para medir as concentrações de proteínas no plasma e lisados ​​celulares. 5-7 Para alcançar quantificação de proteínas, estas moléculas maiores são digeridos para peptídeos componente usando uma enzima, como tripsina. Um ou mais peptídeos selecionados cuja seqüência é exclusivo para a proteína-alvo, em que as espécies (ou seja, &quot;proteotypic&quot; peptídeos) são, então, enriquecido a partir da amostra usando anticorpos anti-peptídeo e medido como substitutos estequiométrica quantitativa para a concentração de proteína na amostra. Assim, acoplado a diluição de isótopos estáveis ​​(SID) (ou seja, um spiked-in isótopo estável rotulados peptídeo standard), SRM / MRM podem ser usados ​​para medir as concentrações de peptídeos proteotypic como substitutos para a quantificação de proteínas em matrizes biológicas complexas. Métodos Os ensaios têm várias vantagens em comparação com imunoensaios tradicional. Os reagentes são relativamente menos caro para gerar, a especificidade para o analito é excelente, os ensaios podem ser altamente multiplexados, de enriquecimento pode ser realizado a partir do plasma puro (sem esgotamento necessário), ea técnica é passível de uma grande variedade de proteínas ou modificações de interesse. 8-13 Neste vídeo podemos demonstrar o protocolo básico, adaptado a uma plataforma magnética talão.

Padrões de Isótopos estáveis ​​e Captura de Anticorpos Anti-Peptide (SISCAPA) casais enriquecimento afinidade de peptídeos com isótopos estáveis ​​de diluição espectrometria de massa (MRM-MS) para fornecer a medição quantitativa de peptídeos como substitutos para suas respectivas proteínas. Aqui nós descrevemos o protocolo usando partículas magnéticas em um formato parcialmente automatizados.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

Há uma grande necessidade de ensaios quantitativos para a medição de proteínas. Os imunoensaios sanduíche tradicionais, amplamente considerados o padrão-ouro em ...

O objetivo geral do procedimento a seguir é isolar e quantificar peptídeos em uma mistura complexa que atuam como substitutos de suas respectivas proteínas. Primeiro, as proteínas grandes dentro da mistura são digeridas em peptídeos componentes utilizando uma enzima como a tripsina. Em seguida, os analitos peptídicos alvo e um padrão interno marcado com isótopo estável adicionado são enriquecidos usando anticorpos antipeptídicos, imobilizados em partículas magnéticas codificadas com proteína G após o isolamento.Os peptídeos-alvo são eluídos das partículas magnéticas e analisados por espectrometria de massas para quantificação relativa ao padrão interno. As principais vantagens dessa técnica em comparação com métodos existentes, como ensaios imunoenzimáticos tradicionais, são sua maior velocidade e eficiência de custo na criação de um grande número de ensaios. Ela apresenta alta taxa de sucesso e pode ser facilmente multiplexada, demonstrando que o procedimento será detalhado.Um técnico no laboratório tem 10 microlitros de plasma Eloqua sobre gelo úmido. Transfira a amostra para uma placa de poços profundos de 1000 microlitros e cubra com filme parafilm. Para desnaturar as proteínas, adicione 20 microlitros de ureia fresca a nove molar e 30 milimolar de DTT a cada amostra e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Adicione três microlitros de iodoacetamida fresca a 500 milimolar a cada amostra e incube por 30 minutos ao abrigo da luz, em temperatura ambiente. Em seguida, dilua a ureia para 0,6 molar com tris 100 milimolar, pH oito, e adicione 10 microlitros de uma solução estoque de tripsina a um micrograma por microlitro, obtendo uma proporção enzima:substrato de 1:50.Após incubar a reação a 37 graus Celsius durante a noite, adicione três microlitros de ácido fórmico puro até uma concentração final de 1% e continue adicionando o padrão de isótopo estável ou múltiplos padrões. Se estiver realizando um ensaio multiplexo, lave bem a placa de cartucho Oasis com 500 microlitros de ácido fórmico 0,1% em acetonitrila a 80%, descartando o fluxo passante. Em seguida, equilibre a placa de cartucho adicionando 500 microlitros de ácido fórmico 0,1% em água e descarte o fluxo passante.Carregue as amostras de digestão na placa de cartucho e ajuste o vácuo para que o fluxo seja muito lento. Lave três vezes com 500 microlitros de ácido fórmico 0,1% em água e descarte o fluxo; elua os peptídeos duas vezes com 500 microlitros de ácido fórmico 0,1% em 80% acetonitrila, depois liofilize ou seque o eluato em velocidade reduzida e reconstitua os peptídeos secos em 50 microlitros de PBS mais 0,03% Chaps. Transfira as amostras para uma placa padrão Kingfisher de 96 poços, adicione um micrograma de anticorpo e 1,5 microlitro de microesferas magnéticas codificadas com proteína G por alvo. Agite as microesferas em vórtex antes da adição.Para garantir que as esferas estejam bem suspensas, cubra a placa com papel alumínio e incube durante a noite com agitação suave em centrífuga. Centrifugue a placa a 400 RPM por 10 segundos para remover qualquer líquido da superfície do papel alumínio.Remova a tampa de alumínio. A manipulação da amostra ocorre em uma plataforma kingfisher automatizada na plataforma Kingfisher. Lave as microesferas duas vezes com 200 microlitros de PBS mais 0,03% de CHAPS e uma vez com 200 microlitros de uma diluição de um para 10 de PBS mais 0,03% de CHAPS. Em seguida, elua os peptídeos com 25 microlitros de ácido acético 5% mais 0,03% de CHAPS.Coloque a placa de eluição sobre um ímã e transfira o eluato para uma placa de 96 poços, tomando cuidado para não transferir as perolas remanescentes. Cubra a placa com a tampa adesiva e encaminhe esta placa contendo o eluato ao espectrômetro de massas triplo ou quádruplo para análise. O método MRM é construído obtendo-se um espectro de massas em tandem do peptídeo de interesse e, em seguida, escolhendo e otimizando os melhores íons fragmentos de transição.Normalmente, uma configuração para análise por MRM utiliza colunas de retenção e analítica C18 com duas fases móveis. Carregue 10 microlitros da amostra e elua com um gradiente linear. Integre as áreas dos picos para os peptídeos leves e pesados e calcule a razão entre as áreas dos picos do peptídeo não marcado e do peptídeo marcado em cada amostra.Os peptídeos leves e pesados eluem ao mesmo tempo e múltiplas transições podem ser monitoradas para cada peptídeo. Para confirmar a identidade, a área do pico do peptídeo endógeno é medida em relação à área do padrão interno, fornecendo uma medida quantitativa do peptídeo-alvo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como implementar esta técnica em seu laboratório. Ela pode ser usada para quantificar qualquer proteína de interesse, tornando-se adequada para uma ampla gama de aplicações na pesquisa biológica.

quantification-proteins-using-peptide-immunoaffinity-enrichment

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a...

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Neste vídeo, demonstramos a imunoprecipitação baseada em anticorpos de fosfopeptídeos de uma mistura de peptídeos. Os fosfopeptídeos enriquecidos são concentrados a vácuo e armazenados para análise a jusante.

Enriquecimento de fosfopeptídeos: uma técnica de imunoprecipitação baseada em anticorpos para separar peptídeos fosforilados específicos de misturas complexas de peptídeos

Rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos por dimetilação redutora (rotulagem Redi) é uma estratégia rápida e barata para proteômica precisos baseados em espectrometria de massa quantitativos. Aqui demonstramos um método robusto para a preparação e análise de misturas de proteínas, utilizando a abordagem de Redi que pode ser aplicado a quase todos os tipos de amostra.

Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

Este protocolo descreve como realizar ensaios de quantificação absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas usando monitoramento de reação selecionado. Foi usado para quantificar com precisão as proteínas da via de sinalização da quimiotaxia de macrófagos de camundongos. A seleção de peptídeos alvo, o desenvolvimento do ensaio e os ensaios qualitativos e quantitativos são descritos em detalhes.

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Um protocolo para a quantificação de proteínas em fluidos biológicos complexos usando tecnologia automatizada imuno-MALDI (iMALDI) é apresentado.

Peptídeos e proteínas quantificação usando Automated imuno-MALDI (iMALDI)

Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Este protocolo descreve um procedimento para extrair e enriquecer o phosphopeptides de linhas de células de câncer de próstata ou tecidos para uma análise da phosphoproteome através de massa baseado em espectrometria proteômica.

Enriquecimento de Fosfopeptida acoplado com espectrometria de massa livre de rótulo quantitativa para investigar o Phosphoproteome no câncer de próstata

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Este fluxo de trabalho descreve o desempenho do enriquecimento tempo e econômico de múltiplas modificações pós-translacionais de proteínas (PTMs) simultaneamente para análise proteômica global quantitativa. O protocolo utiliza o enriquecimento ptm em nível de peptídeo com múltiplos anticorpos conjugados, seguido pela análise de espectrometria de aquisição independente de dados para obter insights biológicos sobre o crosstalk PTM.

Enriquecimento de afinidade simultânea de duas modificações pós-translacionais para quantificação e localização do site

O protocolo descrito fornece uma análise de proteômica quantitativa otimizada das amostras de tecido usando duas abordagens: quantitação baseada em rótulos e sem rótulos. As abordagens baseadas em rótulos têm a vantagem de uma quantitação mais precisa de proteínas, enquanto uma abordagem sem rótulos é mais econômica e usada para analisar centenas de amostras de uma coorte.

Fluxo de trabalho abrangente da proteômica de espingarda baseada em espectrometria de massa de amostras de tecido

Aprenda a técnica SISCAPA para quantificação de peptídeos usando enriquecimento imunoafinidade e espectrometria de massa. Este método automatizado permite análise multiplex rápida e custo-efetiva em pesquisa biológica.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

Explorar mais vídeos