Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

O objetivo geral do procedimento a seguir é isolar e quantificar peptídeos em uma mistura complexa que atuam como substitutos de suas respectivas proteínas. Primeiro, as proteínas grandes dentro da mistura são digeridas em peptídeos componentes utilizando uma enzima como a tripsina. Em seguida, os analitos peptídicos alvo e um padrão interno marcado com isótopo estável adicionado são enriquecidos usando anticorpos antipeptídicos, imobilizados em partículas magnéticas codificadas com proteína G após o isolamento.

Os peptídeos-alvo são eluídos das partículas magnéticas e analisados por espectrometria de massas para quantificação relativa ao padrão interno. As principais vantagens dessa técnica em comparação com métodos existentes, como ensaios imunoenzimáticos tradicionais, são sua maior velocidade e eficiência de custo na criação de um grande número de ensaios. Ela apresenta alta taxa de sucesso e pode ser facilmente multiplexada, demonstrando que o procedimento será detalhado.

Um técnico no laboratório tem 10 microlitros de plasma Eloqua sobre gelo úmido. Transfira a amostra para uma placa de poços profundos de 1000 microlitros e cubra com filme parafilm. Para desnaturar as proteínas, adicione 20 microlitros de ureia fresca a nove molar e 30 milimolar de DTT a cada amostra e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Adicione três microlitros de iodoacetamida fresca a 500 milimolar a cada amostra e incube por 30 minutos ao abrigo da luz, em temperatura ambiente. Em seguida, dilua a ureia para 0,6 molar com tris 100 milimolar, pH oito, e adicione 10 microlitros de uma solução estoque de tripsina a um micrograma por microlitro, obtendo uma proporção enzima:substrato de 1:50.

Após incubar a reação a 37 graus Celsius durante a noite, adicione três microlitros de ácido fórmico puro até uma concentração final de 1% e continue adicionando o padrão de isótopo estável ou múltiplos padrões. Se estiver realizando um ensaio multiplexo, lave bem a placa de cartucho Oasis com 500 microlitros de ácido fórmico 0,1% em acetonitrila a 80%, descartando o fluxo passante. Em seguida, equilibre a placa de cartucho adicionando 500 microlitros de ácido fórmico 0,1% em água e descarte o fluxo passante.

Carregue as amostras de digestão na placa de cartucho e ajuste o vácuo para que o fluxo seja muito lento. Lave três vezes com 500 microlitros de ácido fórmico 0,1% em água e descarte o fluxo; elua os peptídeos duas vezes com 500 microlitros de ácido fórmico 0,1% em 80% acetonitrila, depois liofilize ou seque o eluato em velocidade reduzida e reconstitua os peptídeos secos em 50 microlitros de PBS mais 0,03% Chaps. Transfira as amostras para uma placa padrão Kingfisher de 96 poços, adicione um micrograma de anticorpo e 1,5 microlitro de microesferas magnéticas codificadas com proteína G por alvo. Agite as microesferas em vórtex antes da adição.

Para garantir que as esferas estejam bem suspensas, cubra a placa com papel alumínio e incube durante a noite com agitação suave em centrífuga. Centrifugue a placa a 400 RPM por 10 segundos para remover qualquer líquido da superfície do papel alumínio.

Remova a tampa de alumínio. A manipulação da amostra ocorre em uma plataforma kingfisher automatizada na plataforma Kingfisher. Lave as microesferas duas vezes com 200 microlitros de PBS mais 0,03% de CHAPS e uma vez com 200 microlitros de uma diluição de um para 10 de PBS mais 0,03% de CHAPS. Em seguida, elua os peptídeos com 25 microlitros de ácido acético 5% mais 0,03% de CHAPS.

Coloque a placa de eluição sobre um ímã e transfira o eluato para uma placa de 96 poços, tomando cuidado para não transferir as perolas remanescentes. Cubra a placa com a tampa adesiva e encaminhe esta placa contendo o eluato ao espectrômetro de massas triplo ou quádruplo para análise. O método MRM é construído obtendo-se um espectro de massas em tandem do peptídeo de interesse e, em seguida, escolhendo e otimizando os melhores íons fragmentos de transição.

Normalmente, uma configuração para análise por MRM utiliza colunas de retenção e analítica C18 com duas fases móveis. Carregue 10 microlitros da amostra e elua com um gradiente linear. Integre as áreas dos picos para os peptídeos leves e pesados e calcule a razão entre as áreas dos picos do peptídeo não marcado e do peptídeo marcado em cada amostra.

Os peptídeos leves e pesados eluem ao mesmo tempo e múltiplas transições podem ser monitoradas para cada peptídeo. Para confirmar a identidade, a área do pico do peptídeo endógeno é medida em relação à área do padrão interno, fornecendo uma medida quantitativa do peptídeo-alvo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como implementar esta técnica em seu laboratório. Ela pode ser usada para quantificar qualquer proteína de interesse, tornando-se adequada para uma ampla gama de aplicações na pesquisa biológica.