Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

O objetivo geral do procedimento a seguir é isolar e quantificar peptídeos em uma mistura complexa que atuam como substitutos de suas respectivas proteínas. Primeiro, as proteínas grandes dentro da mistura são digeridas em peptídeos componentes usando uma enzima como a tripsina. Em seguida, os analitos peptídicos direcionados e um padrão interno marcado com isótopo estável enriquecido são enriquecidos com anticorpos antipeptídeo, imobilizados em partículas magnéticas codificadas pela proteína G após o isolamento.

Os peptídeos alvo são aludidos a partir das partículas magnéticas e analisados por espectrometria de massa para quantificação em relação ao padrão interno. As principais vantagens dessa técnica em relação aos métodos existentes, como os imunoensaios tradicionais, é que ela é mais rápida e econômica na construção de um grande número de ensaios. Tem uma alta taxa de sucesso e é facilmente multiplexado, demonstrando que o procedimento será definido.

Um técnico no laboratório Haw um plasma de 10 microlitros Eloqua em gelo úmido. Transfira a amostra para uma placa de poço de 1000 microlitros de profundidade e cubra com filme parábola para desnaturar as proteínas a 20 microlitros de uréia fresca de nove molares 30 milimolares DTT para cada amostra e incube por 30 minutos A 37 graus Celsius, adicione três microlitros de acetamida fresca de 500 milimolares I oto a cada amostra e incube por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. Agora dilua a uréia a 0,6 molar com 100 milimolares tris pH oito e adicione 10 microlitros de um micrograma por microlitro e estoque de solução para uma proporção de uma enzima para 50 para substrato.

Depois de incubar a reação a 37 graus Celsius durante a noite a três microlitros de ácido fórmico puro até uma concentração final de 1%, continue a adicionar o padrão de isótopo estável ou vários padrões. Se estiver realizando um ensaio multiplex, lave bem a placa do cartucho Oasis com 500 microlitros de ácido fórmico a 0,1% em nitrilo 80% ACE, descartando o fluxo. Em seguida, equilibre a placa do cartucho adicionando 500 microlitros de ácido fórmico a 0,1% em água e descarte o fluxo.

Carregue as amostras de digestão na placa do cartucho e ajuste o vácuo para que o fluxo seja muito lento. Lave três vezes com 500 microlitros de ácido fórmico a 0,1% em água e descarte o fluxo através de eluir os peptídeos duas vezes com 500 microlitros de ácido fórmico a 0,1% em 80% de teste de aceto, em seguida, liofilize ou acelere de volta o eluato à secura e reconstitua os peptídeos secos em 50 microlitros de PBS mais 0,03% Chaps transferem as amostras para uma placa padrão Kingfisher de 96 poços, adicione um micrograma de anticorpo e 1,5 microlitros de proteína G contas magnéticas codificadas por alvo. Vortex as contas antes da adição.

Para garantir que as contas estejam bem suspensas. Cubra a placa com papel alumínio e incube durante a noite com uma centrífuga suave. A placa a 400 RPM por 10 segundos para remover qualquer líquido da superfície da folha.

Remova a tampa da folha de alumínio. A manipulação de amostras ocorre em uma plataforma automatizada de martim-pescador na plataforma Kingfisher. Lave as esferas duas vezes com 200 microlitros de PBS mais 0,03% de rachaduras e uma vez com 200 microlitros de uma diluição de um a 10 de PBS mais 0,03% de rachaduras agora iludam os peptídeos com 25 microlitros de 5% de ácido acético mais 0,03% de rachaduras.

Coloque a placa de eluição em um ímã e transfira o eluído para uma placa de 96 poços, tomando cuidado para não transferir as sobras de grânulos. Cobrir a placa com o tapete de tecto, entregar esta placa contendo o eluído ao espectrómetro de massa triplo e quádruplo para análise. O método MRM é construído pela obtenção de um espectro de massa em tandem do peptídeo de interesse do que pela escolha e otimização dos melhores íons de fragmentos de transição.

Normalmente, uma configuração para análise MRM usa uma armadilha C 18 e colunas analíticas com duas fases móveis. Carregue 10 microlitros da amostra e elua por um gradiente linear. Integre as áreas de pico para os peptídeos leves e pesados e calcule a proporção da área de pico do peptídeo não marcado para o marcado em cada amostra.

Os peptídeos leves e pesados eluem ao mesmo tempo e várias transições podem ser monitoradas para cada peptídeo Para confirmar a identidade, a área de pico do peptídeo endógeno é medida em relação à área do padrão interno para fornecer uma medida quantitativa do peptídeo alvo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como implementar essa técnica em seu laboratório. Ele pode ser usado para quantificar qualquer proteína de interesse, tornando-o adequado para uma ampla gama de aplicações em pesquisas biológicas.