Patologia de expansão: um método para imagens ópticas de alta resolução de amostras de tecido clínico

A patologia de expansão, ou ExPath, é uma técnica de preparação de amostras para espécimes biológicos, que permite que a microscopia de luz convencional obtenha imagens de estruturas em nanoescala, expandindo-as usando um sistema de polímeros.

Primeiro, pegue uma lâmina de amostra de tecido imunomarcado processado e cubra-a com uma solução de ancoragem contendo grupos reativos a proteínas e polímeros. O grupo reativo à proteína do reagente de ancoragem se liga às aminas das biomoléculas dentro das células.

Em seguida, adicione uma solução gelificante adequada sobre a amostra e incube para permitir sua difusão dentro do tecido. O grupo polímero-reativo do reagente de ancoragem se liga aos monômeros livres dentro da solução gelificante, permitindo que as biomoléculas se ancorem ao polímero à medida que ele é polimerizado.

Quando a polimerização da amostra estiver concluída, cubra a lâmina com uma solução de proteinase. As proteinases digerem as proteínas do citoesqueleto para remover qualquer resistência estrutural, permitindo que as células se expandam sem se romper. Após a digestão enzimática, a amostra gelificada se desprende da lâmina e entra em suspensão.

Agora, transfira a amostra para um tampão de lavagem apropriado em um recipiente compatível com microscópio. Em seguida, substitua o tampão por água e incuba. O polímero absorve uma enorme quantidade de água em relação à sua massa e incha.

À medida que o polímero se expande, as biomoléculas ancoradas na rede polimérica se afastam, mantendo sua orientação espacial. Isso permite sua fácil visualização sob um microscópio de luz convencional.

Prepare a solução de ancoragem de acordo com as instruções do manuscrito. Coloque as lâminas em uma placa de Petri de 100 milímetros. Pipete a solução de ancoragem sobre o tecido e incube-os por pelo menos 3 horas em temperatura ambiente. Em seguida, prepare a solução gelificante de acordo com as instruções do manuscrito.

Remova o excesso de solução de ancoragem da seção de tecido e coloque a lâmina de volta na placa de Petri. Adicione uma solução gelificante fresca e fria à amostra e incube a mistura por 30 minutos a 4 graus Celsius. Para construir uma câmara na lâmina ao redor da amostra, crie espaçadores cortando pedaços finos de vidro de cobertura com uma faca de diamante. Prenda os espaçadores de cada lado do lenço com água e coloque cuidadosamente uma tampa de vidro sobre a lâmina, evitando prender bolhas de ar sobre o tecido.

Em seguida, incube a amostra a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado por 2 horas. Remova a tampa da câmara de gelificação deslizando suavemente uma lâmina de barbear sob a lamínula e levantando-a lentamente da superfície do gel. Apare o gel em branco ao redor do tecido para minimizar o volume, certificando-se de cortar o gel assimetricamente para rastrear a orientação.

Dilua a proteinase K 1:200 no tampão de digestão, certificando-se de preparar solução suficiente para submergir completamente o gel. Em seguida, incubar a amostra com a solução em um recipiente fechado por 3 horas a 60 graus Celsius. Se a amostra não se soltar durante a digestão, use uma lâmina de barbear para removê-la com cuidado.

Use um pincel macio para transferir a amostra para 1X PBS em um recipiente compatível com o sistema de imagem desejado e grande o suficiente para acomodar o gel totalmente expandido. Lave a amostra em PBS por 10 minutos e, se desejar, core-a novamente com DAPI de 300 milimolares. Expanda as amostras lavando-as com um volume excessivo de água bidestilada 3 a 5 vezes por 10 minutos por lavagem. Em seguida, execute imagens de fluorescência.

• Expansion Pathology (ExPath) - A sample preparation technique for biological specimens.
• Acryloyl-X SE - A protein-reactive group used in the anchoring solution during ExPath.
• BP160/100 - Another term for the anchoring solution used in ExPath.
• P06-1.5H-N - A specific type of gelling solution used in ExPath.
• Gelling Solution - The solution that allows biomolecules to anchor to the polymer in ExPath.

• Introduce Expansion Pathology (ExPath) – A sample preparation technique that enables conventional light microscopy to better visualize nano-scale structures (e.g., ExPath).
• Key Concepts – This includes the use of an anchoring solution and a gelling solution which helps in better visualization (e.g., Acryloyl-X SE, P06-1.5H-N).
• Underlying Mechanisms – These involve the biomolecules anchoring to the polymer as it gets polymerized, followed by the expansion of this polymer (e.g., BP160/100).
• Connect to Experiment – This technique eventually allows biomolecules to retain their spatial orientation while being easily visualized under a microscope.

• What is Expansion Pathology (ExPath) and how does it help in sample preparation for biological specimens?
• What are the steps and key elements used in the Expansion Pathology process?
• How does the use of specific solutions like Acryloyl-X SE and P06-1.5H-N impact the procedure?

• Practical Applications – Expansion Pathology (ExPath) enhances the visualization process in microscopy (e.g., medical research).
• Industry Impact – Sectors like biomedical research and healthcare benefit from this procedure (e.g., diagnostics).
• Societal Importance – Enhancing our ability to study and understand biological specimens at a nano-scale (e.g., medical advancements).
• Link to Scientific Advancements – Improvements in visual imaging can lead to scientific breakthroughs (e.g., disease treatment).