Manipulação genética do rato em desenvolvimento Hipotálamo através

O objetivo geral deste procedimento é transfectar DNA plasmidial no hipotálamo de embriões de camundongo em desenvolvimento intrauterino, a fim de ativar ou reprimir a função de um gene de interesse. Isso é realizado primeiramente anestesiando a camundonga prenhe e expondo o útero por meio de laparotomia. O segundo passo consiste em injetar a solução de DNA no terceiro ventrículo do cérebro embrionário.

Em seguida, o eletrodo positivo é posicionado dentro do útero entre a placenta e a cabeça embrionária. O eletrodo negativo é colocado na superfície uterina externa e pulsos elétricos são aplicados. O passo final consiste em remover os cérebros embrionários transfectados seis dias depois.

Por fim, a microscopia de fluorescência é utilizada para analisar as alterações fenotípicas das células transfectadas, número, forma, posição, expressão de marcadores, entre outras. As principais vantagens desta técnica em comparação com métodos existentes, como a transfeção viral, são, em primeiro lugar, não exigir precauções especiais, e, em segundo lugar, permitir o direcionamento de uma região específica. E em terceiro lugar, com a eletroporação *in utero*, a triagem de genes candidatos é mais rápida.

De modo geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois injetar a solução de DNA no terceiro ventrículo e posicionar corretamente a agulha eletrodo exigem destreza manual avançada, juntamente com alguma experiência. Este método pode ajudar a responder perguntas na área do desenvolvimento hipotalâmico, particularmente aquelas relacionadas à migração celular, bem como ao modo como regiões individuais e núcleos são especificados geneticamente. Inicie este procedimento puxando algumas micropipetas de vidro de boa qualidade, pois são essenciais para reduzir a alta taxa inicial de aborto devido à perda de líquido amniótico.

Para preparar o DNA, dissolva o DNA plasmidial livre de endotoxinas purificado em PBS contendo 0,1% de verde rápido, até uma concentração final de um a dois microgramas por microlitro. O verde rápido tornará a solução injetada visível no ventrículo cerebral embrionário. Em seguida, carregue 10 microlitros da solução de DNA na micropipeta de vidro.

Em seguida, conecte a micropipeta de vidro ao sistema de injeção ou a uma pipeta bucal. Nesta etapa, prepare a mesa cirúrgica com uma placa aquecida e os instrumentos cirúrgicos. Ligue as fontes de luz fria para facilitar a visualização dos embriões. Em seguida, desinfete os instrumentos cirúrgicos utilizando um esterilizador de contas de vidro.

Em seguida, anestesie um camundongo prenhe com isoflurano. Após a anestesia do camundongo, aplique pomada nos olhos para prevenir o ressecamento. Posteriormente, posicione a máscara sobre o rosto para manter a anestesia continuamente.

Agora coloque o camundongo sobre uma placa aquecida com o ventre voltado para cima. Fixe o corpo no lugar prendendo as quatro patas com fita adesiva. Certifique-se de que o camundongo está completamente anestesiado pinçando a cauda para verificar o reflexo de retirada.

Em seguida, depile a superfície abdominal e desinfecte-a com solução de iodo. Faça uma incisão longitudinal de cerca de um a um centímetro e meio de comprimento na pele abdominal. Posteriormente, corte o peritônio.

Em seguida, coloque gaze de algodão ao redor da incisão. Enxágue a gaze com PBS. Exponha um corno uterino puxando-o cuidadosamente com pinça romba.

Evite puxar fortemente o miométrio ou o útero. Uma vez que a alta pressão dentro do útero aumentará as chances de perda do fluido embrionário durante a injeção, o que pode resultar em aborto. Em seguida, coloque o cornete uterino sobre uma gaze lavada com PBS e lave-o com PBS a cada poucos minutos para mantê-lo umedecido.

Agora, sob o microscópio, segure o útero de forma que os ventrículos cerebrais possam ser visualizados. Não reposicione extensivamente o embrião que se encontra em uma posição desfavorável. Isso apenas aumenta as chances de aborto.

Observe a cabeça do embrião de cima para localizar a abertura onde ocorre a fissura entre os hemisférios corticais esquerdo e direito. Os hemisférios são fáceis de distinguir, e os ventrículos laterais no seu interior geralmente podem ser percebidos como formas um pouco mais escuras. Se um embrião for encontrado perfeitamente orientado para a injeção de DNA, é possível perfurar a parede uterina e acessar imediatamente o terceiro ventrículo.

Segure a micropipeta de vidro com o DNA preparado anteriormente a 45 graus em relação à parede uterina e perfure-a na extremidade rostral da fissura inter-hemisférica, penetrando cerca de um milímetro de profundidade. Dessa forma, a ponta da micropipeta de vidro entrará no terceiro ventrículo do cérebro e não no ventrículo lateral. Em seguida, injete cerca de um microlitro da solução de DNA no terceiro ventrículo; em uma injeção bem-sucedida, o líquido verde preencherá o ventrículo. Repita o mesmo procedimento com todos os embriões do mesmo cornete uterino.

Isso permitirá um tempo para que a solução de DNA se misture uniformemente com o líquido ventricular e alcance todo o neuroepitélio. Agora, ligue o eletroporador e ajuste as configurações de acordo com a idade embrionária. Utilize a agulha de eletrodo de aço inoxidável como polo positivo e o eletrodo redondo e plano como polo negativo; selecione os embriões com o lado dorsal voltado para cima para a eletroporação.

Em seguida, perfure a parede uterina ao lado da cabeça do embrião, entre o saco amniótico e a placenta, introduzindo a ponta do eletrodo em direção descendente através dela. Depois, use o dedo indicador da outra mão como apoio para a penetração. Cerca de cinco milímetros da ponta do eletrodo devem ficar posicionados entre o saco amniótico e a parede uterina, aproximadamente ao nível do mesencéfalo.

Como este é o eletrodo de direcionamento, sua posição determinará qual parte do neuroepitélio hipotalâmico tem maior probabilidade de ser transfectada. Em seguida, posicione o eletrodo circular e plano do lado de fora da parede uterina, no lado oposto à cabeça do embrião, com a outra mão. Então, comprima suavemente o embrião entre os eletrodos.

Use o interruptor pedal para aplicar a voltagem. Em seguida, retire lentamente o eletrodo de agulha do útero, segurando o útero com o dedo indicador da outra mão. Se o líquido amniótico for perdido através da parede perfurada, normalmente o embrião sofrerá aborto.

Após a injeção e eletroporação de todos os embriões, recoloque cuidadosamente o útero de volta na cavidade abdominal do camundongo, posicionando-os exatamente como estavam anteriormente. Em seguida, umedeça a cavidade peritoneal com solução salina antes de fechá-la. Suture o peritônio com fio cirúrgico de tripa, depois suture a pele com um fio mais resistente.

Desinfete a superfície do abdômen com solução de iodo e injete um anti-inflamatório não esteroide por via subcutânea para alívio da dor. Em seguida, retire a mãe do aparelho de anestesia e coloque-a em uma gaiola aquecida por um tapete aquecedor. Monitore o camundongo até que ele se recupere completamente da anestesia e verifique diariamente se está se recuperando do procedimento sem qualquer sinal de infecção ou dor.

Nesta etapa, colete os embriões ou pós-natais de acordo com o dia desejado de análise. Selecione os embriões que foram injetados com DNA e eletroporados e dissecque os cérebros sob este microscópio estereoscópico. Em seguida, verifique a presença do sinal fluorescente verde na região apropriada.

Para analisar o cérebro do embrião selecionado, fixe o tecido por um curto período em paraformaldeído 4%. Em seguida, inclua-o em ágar 4% ou em albumina gelatina. Então, seccione o cérebro no vibrátomo.

Essas figuras mostram o hipotálamo após transfeção intraútero de DNA plasmidial, carregando genes repórter fluorescentes, GFP ou CFP, no E 12,5. Esta é uma seção sagital mostrando um hipotálamo transfectado do polo rostral ao caudal, e aqui está a seção transversal com as células marcadas em diferentes níveis ao longo do eixo medial-lateral. Esta seção sagital mostra um corpo mamilário especificamente transfectado e a marcação de sua árvore axonal característica, e no lado contralateral desta seção transversal observa-se uma faixa marcada correspondente a neurônios nascidos no E 12,5.

Para analisar mais detalhadamente as seções. Foram preparadas seções horizontais paralelas ao plano dos processos gliais radiais que emanam do recesso mamilar. Os neurônios ambi O originados do neuroepitélio transfectado no dia E 12,5 foram identificados no dia E 18,5 por meio de anticorpos contra GFP.

Neste exemplo, o anticorpo marcou um grupo restrito de células do MBO. Esse grupo estava localizado entre duas áreas laterais e mediais do MBO não marcadas, correspondentes a neurônios do MBO nascidos antes e depois do E 12,5, e a coloração dupla com um anticorpo contra nestina. Em vermelho, observa-se o modo de migração de neurônios individualmente marcados nos prolongamentos gliais radiais do neuroepitélio. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 30 minutos, se for executada corretamente.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como injetar o DNA no terceiro ventrículo e de como posicionar a agulha como eletrodo positivo entre a cabeça do embrião e a placenta, a fim de direcionar com eficiência o hipotálamo. Após este procedimento, outros métodos, como imunohistoquímica ou hibridização in situ, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre o fenótipo dos neurônios transfectados.