Manipulação genética do rato em desenvolvimento Hipotálamo através In utero Eletroporação

O objetivo geral deste procedimento é transfectar o DNA plasmático para o hipotálamo de embriões de camundongos que se desenvolvem no útero, a fim de ativar ou reprimir a função de um gene de interesse. Isso é feito anestesiando primeiro a rata grávida e expondo o útero por laparotomia. O segundo passo é injetar a solução de DNA no terceiro ventrículo do cérebro embrionário.

Em seguida, o eletrodo positivo é posicionado dentro do útero entre a placenta e a cabeça embrionária. O eletrodo negativo é colocado na superfície uterina externa e pulsos elétricos são aplicados. A etapa final é remover os cérebros embrionários transfectados seis dias depois.

Em última análise, a microscopia de fluorescência é usada para analisar as alterações fenotípicas das células transfectadas, número, forma, posição, expressão de marcadores, etc. As principais vantagens desta técnica sobre os métodos existentes, como a transfecção viral, são: primeiro, não requer precauções especiais e, como duas instalações, é possível o segundo direcionamento de uma região específica. E terceiro, com a eletroporação Ute, a triagem de genes candidatos é mais rápida.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque injetar a solução de DNA no terceiro ventrículo e posicionar o eletrodo da agulha corretamente requer inclinação manual avançada junto com alguma experiência. Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo do desenvolvimento hipotalâmico, particularmente aquelas relevantes para a migração celular, bem como como regiões individuais e núcleos são geneticamente especificados. Comece este procedimento puxando algumas micropipetas de vidro de boa qualidade, pois são essenciais para reduzir a alta taxa inicial de aborto devido à perda de líquido amniótico.

Para preparar o DNA, dissolva o DNA plasmático livre de endotoxina purificado em PBS contendo 0,1% de verde rápido até uma concentração final de um a dois microgramas por microlitro. O verde rápido tornará a solução injetada visível no ventrículo cerebral embrionário. Em seguida, carregue 10 microlitros da solução de DNA na micropipeta de vidro.

Em seguida, conecte a micropipeta de vidro ao sistema de injeção ou a uma pipeta bucal. Nesta etapa, prepare a mesa cirúrgica com uma almofada de aquecimento e os instrumentos cirúrgicos Ligue as fontes de luz fria para facilitar a visualização dos embriões. Em seguida, desinfete as ferramentas cirúrgicas usando um esterilizador de esferas de vidro.

Em seguida, anestesiar um camundongo prenhe com éde flúor. Depois que o mouse for anestesiado, aplique pomada nos olhos para evitar o ressecamento. Em seguida, coloque a máscara em seu rosto para manter a anestesia continuamente.

Agora coloque o mouse em uma almofada de aquecimento com a barriga para cima. Prenda seu corpo no lugar fixando seus quatro membros com fita adesiva. Certifique-se de que o mouse esteja completamente anestesiado, beliscando a cauda para refluxo.

Em seguida, raspe a superfície abdominal e desinfete-a com solução de iodo. Faça uma incisão longitudinal com cerca de um a um centímetro e meio de comprimento na pele abdominal. Depois, corte o peritônio.

Em seguida, coloque gaze de algodão ao redor da incisão. Enxágue a gaze com PBS. Exponha um chifre uterino puxando-o cuidadosamente com uma pinça romba.

Evite puxar o miométrio ou o útero com força. Uma vez que a alta pressão dentro do útero aumentará as chances de perda de fluido embrionário após a injeção, resultando em aborto. Em seguida, coloque o chifre uterino em uma gaze enxaguada com PBS e enxágue-o com PBS a cada poucos minutos para mantê-lo umedecido.

Agora, sob o microscópio, segure o útero de forma que os ventrículos cerebrais possam ser visualizados. Não reposicione extensivamente o embrião que está em uma posição desfavorável. Isso só aumenta as chances de aborto.

Olhe para a cabeça do embrião de cima para localizar a lacuna onde se fissura entre os hemisférios corticais esquerdo e direito. Os hemisférios são fáceis de distinguir e os ventrículos laterais dentro deles geralmente podem ser percebidos como formas um pouco mais escuras. Se um embrião estiver perfeitamente orientado para injeção de DNA, é possível perfurar a parede uterina e entrar no terceiro ventrículo de uma só vez.

Segure a micropipeta de vidro com o DNA preparado anteriormente a 45 graus em relação à parede uterina e perfure-a na extremidade rostral da fissura inter-hemisférica, penetrando até cerca de um milímetro de profundidade. Desta forma, a ponta da micropipeta de vidro entrará no terceiro ventrículo do cérebro e não no ventrículo lateral. Após a injeção de cerca de um microlitro de solução de DNA no terceiro ventrículo, o fluido verde preencherá o ventrículo em uma boa injeção, repita o mesmo procedimento com todos os embriões do mesmo chifre do útero.

Isso permitirá algum tempo para que a solução de DNA se misture uniformemente com o fluido ventricular e atinja todo o neuroepitélio. Agora ligue o eletroperter e ajuste as configurações de acordo com a idade embrionária. Use o eletrodo de agulha de aço inoxidável como pólo positivo e o eletrodo plano redondo como pólo negativo, selecione os embriões com o lado dorsal para cima para eletroporação.

Em seguida, perfure a parede uterina próxima à cabeça do embrião entre o saco amniótico e a placenta, empurrando a ponta do eletrodo da agulha para baixo através dele. Em seguida, use o dedo indicador da outra mão como um bloco de impulso. Cerca de cinco milímetros da ponta do eletrodo devem estar entre o saco amniótico e a parede uterina aproximadamente no nível do mesencéfalo.

Como este é o eletrodo alvo, sua posição determinará qual parte do neuroepitélio hipotalâmico tem maior probabilidade de ser transfectada. Em seguida, posicione o eletrodo redondo e plano fora da parede do útero no lado oposto da cabeça do embrião com a outra mão. Em seguida, aperte suavemente o embrião entre os eletrodos.

Use o pedal para aplicar voltage. Depois disso, puxe lentamente o eletrodo da agulha para fora do útero enquanto segura o útero com o dedo indicador da outra mão. Se o líquido amniótico for perdido através da parede perfurada, geralmente o embrião será submetido ao aborto.

Após a injeção e eletroporação de todos os embriões, coloque o útero de volta no abdômen do camundongo com muito cuidado e posicione-os exatamente como eram antes. Em seguida, umedeça a cavidade peritoneal com solução salina antes de fechá-la. Suturar o peritônio com intestino cirúrgico de gato e, em seguida, suturar a pele com uma sutura mais resistente.

Desinfete a superfície do abdômen com solução de iodo e injete um anti-inflamatório não esteróide por via subcutânea para alívio da dor. Em seguida, retire a mãe da máquina anestésica e coloque-a em uma gaiola, que é aquecida por uma almofada de aquecimento. Monitore o mouse até que ele esteja completamente recuperado da anestesia e verifique-o diariamente para garantir que ele esteja se recuperando do procedimento sem nenhum sinal de infecção ou dor.

Nesta etapa, colha os embriões ou pós-natais de acordo com o dia desejado da análise. Selecione os embriões que foram injetados com DNA e eletroporados e disseque os cérebros sob este microscópio estereoscópico. Em seguida, verifique se há sinal fluorescente verde na região apropriada.

Para analisar o cérebro do embrião selecionado, fixe o tecido por um curto período de tempo em 4% de paraldeído. Em seguida, incorpore-o em aros 4% ou em gelatina albumina. Em seguida, seque o cérebro no vibrato.

Essas figuras mostram o hipotálamo após a transfecção in utero do DNA plasmático, carregando genes repórteres fluorescentes, GFP ou CFP em E 12,5. Esta é uma seção sagital mostrando um hipotálamo transfectado de rostral para coddle, e aqui está a seção transversal com as células marcadas em diferentes níveis ao longo do eixo lateral da mídia. Esta seção sagital mostra um corpo mamilar especificamente transfectado e a marcação de sua árvore axonal característica, e no lado do eletrodesfile desta seção transversal mostra uma banda marcada correspondente aos neurônios nascidos em E 12.5.

Para analisar as seções mais de perto. Foram confeccionados os cortes horizontais paralelos ao plano dos processos gliais radiais que emanam do recesso mamilar. Os neurônios ambi O nascidos do neuroepitélio transfectado no dia E 12.5 foram identificados no dia E 18.5 por meio de anticorpos contra GFP.

Neste exemplo, o anticorpo rotulou um grupo restrito de células MBO. Este grupo foi localizado entre duas áreas MBO laterais e mediais não marcadas correspondentes a neurônios MBO, nascidos antes e depois de E 12.5, e a coloração co com um anticorpo contra neston. Em vermelho mostra o modo de migração de neurônios marcados individualmente nos processos gliais radiais do neuroepitélio Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em 30 minutos se for realizada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como injetar o DNA no terceiro ventrículo e como posicionar a agulha como eletrodo positivo entre o embrião, a cabeça e a placenta para atingir com eficiência o hipotálamo. Seguindo este procedimento. Outros métodos, como imuno-histoquímica ou hibridização de inídeos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre o fenótipo dos neurônios transfectados.