Ferramentas de edição de base mediadas por CRISPR: uma técnica de edição de genoma para induzir a substituição de base direcionada

Para edição de genoma mediada por CRISPR, comece com a cultura HAP1-BE3, uma linha celular haplóide com um gene BE integrado que codifica uma enzima editora de base. A esta cultura, adicione vetores lentivirais contendo plasmídeo CRISPR-Cas9 projetado para um alvo específico, como o gene do câncer de mama humano, BRCA1.

A partícula de lentivírus se funde com a membrana da célula hospedeira, liberando o plasmídeo, que eventualmente se integra ao genoma da célula hospedeira para formar os segmentos do gene CRISPR-Cas9-BE. Esses genes geram um gRNA direcionado a BRCA1, endonuclease Cas9 e BE-citidina desaminase.

O gRNA direcionado ao BRCA1 é um RNA que se funde com Cas9 e direciona o complexo para o locus do gene BRCA1. Perto desse gene, o locus é um Motivo Adjacente ao Protoespaçador, ou PAM, onde o BE pode atracar de forma estável e mover-se rio acima para alcançar sua região catalítica ativa. Aqui, o BE reconhece uma base de citidina e a converte em uridina.

Essa mutação de substituição de base aciona a nuclease Cas9 para cortar a fita de DNA não modificada. A quebra da fita de DNA ativa enzimas de reparo que preenchem a base ausente e convertem o uracila, uma base não relacionada