Ferramentas de edição de base mediadas por CRISPR: uma técnica de edição de genoma para induzir a substituição de base direcionada

Para edição de genoma mediada por CRISPR, comece com a cultura HAP1-BE3, uma linha celular haplóide com um gene BE integrado que codifica uma enzima editora de base. A esta cultura, adicione vetores lentivirais contendo plasmídeo CRISPR-Cas9 projetado para um alvo específico, como o gene do câncer de mama humano, BRCA1.

A partícula de lentivírus se funde com a membrana da célula hospedeira, liberando o plasmídeo, que eventualmente se integra ao genoma da célula hospedeira para formar os segmentos do gene CRISPR-Cas9-BE. Esses genes geram um gRNA direcionado a BRCA1, endonuclease Cas9 e BE-citidina desaminase.

O gRNA direcionado ao BRCA1 é um RNA que se funde com Cas9 e direciona o complexo para o locus do gene BRCA1. Perto desse gene, o locus é um Motivo Adjacente ao Protoespaçador, ou PAM, onde o BE pode atracar de forma estável e mover-se rio acima para alcançar sua região catalítica ativa. Aqui, o BE reconhece uma base de citidina e a converte em uridina.

Essa mutação de substituição de base aciona a nuclease Cas9 para cortar a fita de DNA não modificada. A quebra da fita de DNA ativa enzimas de reparo que preenchem a base ausente e convertem o uracila, uma base não relacionada ao DNA, em timina. No geral, esses processos geram uma variante genética.

Agora, incube as células em condições fisiológicas e subcultura para multiplicar a variante do gene. Extraia o DNA genômico e sequencie-o para analisar a eficiência de edição de bases mediada por CRISPR.

Semeie 5 x 10⁵ células HAP1-BE3 por poço em placas de 24 poços um dia antes da transfecção e cultive-as para atingir 70% a 80% de confluência para transfecção. RNAs guia de direcionamento de BRCA1 transfectados usando os reagentes de transfecção de compra, de acordo com o protocolo do fabricante. Use 1 micrograma de RNAs guia de direcionamento BRCA1 para induzir a conversão de CG em TA em locais-alvo BRCA1. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius e subcultive a cada 3 a 4 dias. Colha os pellets celulares 3, 10 e 24 dias após a transfecção para analisar as eficiências de edição de base. Extraia DNA genômico usando o kit de purificação de DNA genômico.