Ensaio de Bicamada Lipídica Planar: Uma Técnica In Vitro Baseada em Microscopia para Investigar a Montagem de Septina em Mimetizadores de Membrana Biológica

As septinas são proteínas do citoesqueleto que compreendem um domínio de ligação ao GTP flanqueado por domínios amino e carboxila terminais, com uma capacidade inerente de se auto-montar em filamentos e estruturas de ordem superior na membrana plasmática interna para diversas funções celulares.

Para estudar as interações septina-membrana in vitro usando uma imitação de membrana biológica, obtenha um tubo de microcentrífuga cortado. Aplique adesivo ultravioleta sobre a borda plana e sem cortes e posicione-a sobre uma lamínula de vidro hidrofilizada tratada com plasma. Após a exposição à luz ultravioleta, o adesivo cura, criando uma câmara de reação aberta.

Transfira vesículas lipídicas unilamelares zwitteriônicas monodispersas da composição lipídica desejada, suplementadas com tampão contendo cátions mono e divalentes, para a câmara. Os cátions facilitam que as vesículas lipídicas sejam adsorvidas e se acumulem na lamínula. Agite suavemente a câmara, iniciando a ruptura da vesícula, e incuba.

As vesículas rompidas se desdobram e se fundem à lamínula por meio de seus grupos de cabeça hidrofílicos, formando manchas planares de bicamada lipídica. As bordas dos adesivos desencadeiam a ruptura das vesículas remanescentes, gerando uma bicamada lipídica contínua com suporte planar, SLB. Remova o excesso de vesículas não adsorvidas com tampão adequado.

Em seguida, adicione suspensão de septina marcada com fluorescência com tampão contendo agente de aglomeração e incuba. Os agentes de apinhamento permitem que as septinas se depositem na lamínula revestida com SLB. Em condições ideais, as septinas podem se associar aos lipídios da BLS, reunindo-se em estruturas organizadas.

Ilumine seletivamente a lamínula usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total para excitar septinas marcadas com fluorescência aderidas no SLB para observar a montagem das septinas.

Para iniciar a limpeza de plasma das lâminas, purgue o limpador de plasma por 5 minutos com oxigênio para remover o ar das linhas e da câmara. Disponha as lâminas de vidro de cobertura secas em um berço de cerâmica. Durante a purga, passe um gás inerte sobre as microlâminas de vidro de cobertura para remover poeira e partículas.

Coloque o berço na parte de trás da câmara de plasma de modo que as lamínulas fiquem paralelas à borda longa da câmara. Execute o limpador de plasma por 15 minutos com oxigênio na potência máxima.

Para a preparação da câmara, corte a tampa logo abaixo da parte fosca de um tubo de PCR de 0,2 mililitro. Pinte a borda do tubo de PCR com adesivo ativado por UV, evitando o interior do tubo. Coloque suavemente o tubo de PCR colado no centro de uma lamínula limpa por plasma e, em seguida, coloque a câmara sob luz UV de comprimento de onda longo por 5 a 7 minutos para curar o adesivo.

Para formar uma bicamada, adicione os reagentes ao poço. Agite suavemente as câmaras de um lado para o outro para interromper os SUVs e, em seguida, incube a 37 graus Celsius por 20 minutos.

Após a incubação, enxágue a bicamada 6 vezes com 150 microlitros de SLBB, pipetando para remover o excesso de lipídios. Em seguida, lave a bicamada 6 vezes com 150 microlitros de tampão de reação, antes de incubar com as septinas.

Na última etapa de lavagem, remova o tampão de reação, deixando 75 microlitros no poço. Adicione 25 microlitros de septinas diluídas em SSB e imagem por microscopia TIRF.