Ensaio de triagem de nematicidas de moléculas pequenas: um método de rendimento médio para rastrear nematicidas potenciais contra Ditylenchus dipsaci

Nematóides parasitas de plantas, como Ditylenchus dipsaci, são vermes microscópicos. Os vermes vivos exibem movimentos sinusoidais por meio de contrações musculares, e sua motilidade é um importante determinante de sua saúde em condições de cultivo.

A exposição a nematicidas - tóxicos químicos, pode interferir nos principais processos biológicos, afetando a mobilidade desses nematóides cultivados, levando à sua morte.

Para rastrear nematicidas de moléculas pequenas, pegue uma placa de vários poços contendo água destilada. Usando uma ferramenta de fixação limpa, transfira os potenciais pequenos nematicidas moleculares da placa de estoque de produtos químicos para a placa de ensaio para garantir uma transferência de quantidades consistentes de moléculas para cada poço.

Dispense um número igual de nematóides para cada poço da placa. Sele as placas enquanto mantém condições úmidas para apoiar a sobrevivência e a mobilidade do nematóide. Incube a placa com agitação suave para evitar que os vermes se instalem.

Durante a incubação, várias pequenas moléculas tóxicas atuam sobre os vermes e os matam, enquanto as não tóxicas não têm impacto. Observe a placa sob um microscópio de dissecação para identificar os poços com uma população de vermes imóveis.

Completar as placas de ensaio com solução de hidróxido de sódio - estimulante químico de ponto final. Isso desencadeia o movimento de qualquer verme em repouso e os diferencia dos mortos.

A presença de vermes imóveis após o tratamento com hidróxido de sódio em alguns poços confirma a eficácia das pequenas moléculas correspondentes como nematicidas.

Para preparar as placas de ensaio, despeje água destilada autoclavada em uma calha estéril e dispense 40 microlitros de água destilada da calha em cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços com uma pipeta multicanal. Adicione produtos químicos das placas de estoque de produtos químicos de 96 poços às placas de ensaio, fixando três vezes na placa química. Em seguida, transfira os pinos 10 vezes para a placa de ensaio. Seque no papel na frente da solução de limpeza.

Para contar o número de nematóides da coleção, primeiro ressuspenda a coleção e, em seguida, pipete 5 microlitros da solução usando pontas de baixa retenção em uma lâmina. Conte o número de nematóides em 5 microlitros usando um microscópio de dissecação. Em seguida, ajuste a concentração para dois vermes por microlitro usando água destilada estéril.

Em seguida, adicione 10 microlitros da amostra a cada poço das placas de 96 poços com uma pipeta multicanal e uma calha. Embrulhe os pratos com uma toalha de papel úmida e coloque-os em uma caixa. Em seguida, adicione uma toalha de papel úmida extra para estabilizar e garantir o mínimo de movimento das placas e fixe em uma almofada adesiva em uma incubadora de agitação de 20 graus Celsius ajustada para 200 rpm.

Observe as placas no dia 5 sob um microscópio de dissecação. Conte o número de D. dipsaci móveis e totais em controles de solvente DMSO e poços tratados com medicamentos.

Se os vermes estiverem imóveis, adicione 2 microlitros de hidróxido de sódio 1 molar a uma concentração final de 40 milimolares ao poço para estimular o movimento. Calcule a proporção de vermes móveis. Nas telas de D. dipsaci, os poços que produziram 0% de worms móveis de forma reprodutível são categorizados como fortes acertos.