PCR digital duplex para quantificação simultânea de marcadores genéticos duplos

reação em cadeia da polimerase digital duplex - ddPCR - permite a detecção quantitativa simultânea de dois marcadores genéticos distintos.

Para começar, pegue uma amostra contendo duas sequências de alvos diferentes. Adicione uma mistura contendo uma enzima DNA polimerase termoestável, dNTPs e primers específicos para o alvo. Em seguida, adicione duas sondas de oligonucleotídeos específicas de alvo diferentes, marcadas com repórteres fluorescentes e uma molécula de têmpera para detectar alvos amplificados.

A solução é emulsionada com óleo para dividir as sequências alvo em numerosas nanogotículas. Cada gota contendo o alvo atua como um recipiente de reação individual.

Inicie o processo de ciclagem térmica para a reação de amplificação dentro das nanogotículas individuais.

A uma alta temperatura de desnaturação, os alvos de fita dupla se separam em fitas simples.

Abaixe a temperatura para atingir a temperatura de recozimento apropriada, permitindo que os primers e as sondas de oligonucleotídeos se liguem ao molde.

A proximidade do supressor suprime a fluorescência do repórter. Na temperatura de extensão, a DNA polimerase estende os primers e cliva a sonda de oligonucleotídeos. O repórter não encadernado emite fluorescência.

Passe as gotículas por um leitor de gotículas - um sistema de detecção de fluorescência. A detecção de fluorescência simples ou dupla indica gotículas positivas contendo alvos, enquanto a ausência de um sinal indica gotículas negativas.

A proporção de gotículas positivas para o número total de partições determina a concentração inicial das sequências alvo.

Para iniciar este procedimento, primeiro prepare concentrações de estoque de 100 micromoles por litro para todos os primers em água de grau molecular e sondas em tampão TE pH 8, conforme descrito no texto do protocolo. Em seguida, prepare uma mistura principal misturando quantidades apropriadas de mistura de PCR digital, primers diretos e reversos, a sonda fluorescente e água livre de nuclease. Pipete para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução.

Como o master mix de dPCR é mais viscoso do que o master mix convencional de qPCR, é necessário usar a técnica de mistura por pipetagem para criar uma solução homogênea. Isso permite uma quantificação precisa do dPCR a jusante.

Para fazer a mistura de ensaio para geração de gotículas para amostras em duplicata, pipete 36 microlitros da mistura principal em uma placa de PCR regular. Para cada uma das misturas principais de 36 microlitros, misture 12 microlitros de molde de DNA, deixando os poços replicados correspondentes vazios na placa. Inclua controles positivos para garantir que o ensaio esteja funcionando corretamente. Inclua controles sem modelo ou NTCs para garantir que não haja contaminação dentro da placa e para definir a linha de base fluorescente posteriormente para análise de dados.

Antes de configurar o gerador de gotículas, misture as misturas de ensaio usando uma pipeta multicanal para pipetar as misturas para cima e para baixo aproximadamente 15 vezes. Certifique-se de que a ponta da pipeta permaneça dentro do líquido para evitar bolhas excessivas na mistura.

Em seguida, insira o cartucho um, contendo oito poços, em um porta-cartucho branco e feche o porta-cartucho. O cartucho um agora está firmemente no lugar e não pode ser desalojado do suporte enquanto gera gotículas.

Usando uma pipeta multicanal, transfira suavemente 20 microlitros da mistura de ensaio para a posição central do cartucho marcado como 'Amostra' sem introduzir bolhas de ar. Pipete 70 microlitros de óleo de geração de gotículas para o lado esquerdo do cartucho marcado como 'Óleo'.

Cubra o cartucho com uma junta, certificando-se de que a junta esteja plana e presa uniformemente pelos quatro tiques em direção à borda do cartucho. Pressione o botão verde aceso no gerador de gotículas para abrir a porta e colocar o cartucho. Pressione o botão novamente para fechar o gerador. Assim que a porta se fecha, o botão verde é escurecido e a porta não pode ser reaberta.

A geração de gotículas começará imediatamente e continuará por aproximadamente 1 minuto.

Enquanto a geração de gotículas estiver em andamento, coloque o cartucho dois em um segundo suporte de cartucho branco e prepare-o da mesma maneira que para o cartucho um. Quando a geração de gotículas estiver concluída, o botão mal iluminado ficará verde.

Abra a porta do gerador de gotículas. Remova o suporte do cartucho branco que contém o cartucho um e coloque-o de lado. Coloque o cartucho dois no gerador de gotículas.

Remova a junta do cartucho um e descarte. Não desclique o suporte do cartucho branco, pois a ação pode quebrar as gotículas recém-geradas.

Usando uma pipeta multicanal ajustada para 40 microlitros, insira as pontas na terceira coluna das gotículas marcadas com cartucho em um ângulo de 45 graus e pipete lentamente todas as gotículas. Transfira-os para a placa de PCR final, colocando a ponta da pipeta contra a parede do poço aproximadamente na metade e expelindo a gota lentamente.

Da mesma forma, quando a geração de gotículas para o cartucho dois estiver concluída, remova a junta do cartucho dois e transfira as gotículas geradas para a placa PCR final. Coloque uma tampa de alumínio perfurável em cima da placa e coloque-a em um selador de placas. Defina o selador para 180 graus Celsius. Pressione "Play" no selador e sele por 10 segundos.

Para iniciar este procedimento, coloque a placa PCR final selada no termociclador. Use um termociclador compatível com a placa PCR final e com uma velocidade de rampa de temperatura de 2 graus Celsius por segundo.

Execute o seguinte programa térmico: 10 minutos a 95 graus Celsius seguidos de 40 ciclos de 30 segundos a 94 graus Celsius e 60 segundos a 60 graus Celsius seguidos de uma espera de 10 minutos a 98 graus Celsius. Após a conclusão do ciclo, transfira a placa para um leitor de gotículas para medição automática de fluorescência em cada gota em cada poço.

Certifique-se de que as gotículas estejam em temperatura ambiente antes de prosseguir com a leitura das gotículas. Comece abrindo o software que acompanha para configurar a leitura de gotículas. No menu padrão "Configuração" que contém um esquema de uma placa vazia de 96 poços, clique duas vezes no poço A1 para abrir o menu que contém três seções - "Amostra", "Ensaio 1" e "Ensaio 2".

Na seção de amostra, digite o ID da amostra na caixa "Nome" e marque a caixa à direita marcada como "Aplicar". Em seguida, clique no menu suspenso "Experimentar". Escolha "RED" para Detecção de Eventos Raros e clique em 'Enter'.

Vá para a seção indicada como "A1". Na seção "Nome", preencha o ensaio e clique em 'Enter'. Na caixa abaixo rotulada como "Tipo", clique no menu suspenso, escolha "Canal 1 Desconhecido" e clique em 'Enter'.

Vá para a seção indicada como "A2". Na seção "Nome", preencha o ensaio e clique em 'Enter'. Na caixa abaixo rotulada como "Tipo", clique no menu suspenso, escolha "Canal 2 Desconhecido" e clique em 'Enter'.

Todas as informações das etapas anteriores agora estão presentes no poço A1.

Nomeie todos os poços subsequentes contendo gotículas. Para economizar o tempo total de configuração, clique em 'Shift' ou 'Control' para escolher vários poços simultaneamente. Quando a representação digital da placa espelhar a placa física, pressione "OK" no canto inferior direito do menu. No novo menu que aparece na parte superior do esquema da placa, na seção "Modelo", escolha "Salvar como" e nomeie e salve a placa.

À esquerda da tela, clique em "Executar" e selecione o conjunto de tintura apropriado na janela pop-up "Opções de execução". A coleta de dados será iniciada e exibida em tempo real no software.