PCR digital duplex para quantificação simultânea de marcadores genéticos duplos

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reação em cadeia da polimerase digital duplex - ddPCR - permite a detecção quantitativa simultânea de dois marcadores genéticos distintos.

Para começar, pegue uma amostra contendo duas sequências de alvos diferentes. Adicione uma mistura contendo uma enzima DNA polimerase termoestável, dNTPs e primers específicos para o alvo. Em seguida, adicione duas sondas de oligonucleotídeos específicas de alvo diferentes, marcadas com repórteres fluorescentes e uma molécula de têmpera para detectar alvos amplificados.

A solução é emulsionada com óleo para dividir as sequências alvo em numerosas nanogotículas. Cada gota contendo o alvo atua como um recipiente de reação individual.

Inicie o processo de ciclagem térmica para a reação de amplificação dentro das nanogotículas individuais.

A uma alta temperatura de desnaturação, os alvos de fita dupla se separam em fitas simples.

Abaixe a temperatura para atingir a temperatura de recozimento apropriada, permitindo que os primers e as sondas de oligonucleotídeos se liguem ao molde.

A proximidade do supressor suprime a fluorescência do repórter. Na temperatura de extensão, a DNA polimerase estende os primers e cliva a sonda de oligonucleotídeos. O r