PCR digital baseado em chip em tubo para quantificação de variantes de nucleotídeo único

A reação em cadeia da polimerase digital - ou dPCR - é útil para quantificar variantes de nucleotídeo único - ou SNVs - uma mutação em que a substituição de um único nucleotídeo em uma posição específica no genoma cria duas variações de nucleotídeos ou alelos.

Para iniciar a quantificação usando a técnica de dPCR chip-in-a-tube, pegue uma amostra de DNA contendo SNVs - o alelo mutante e o alelo do tipo selvagem correspondente. Adicione uma mistura contendo uma enzima DNA polimerase termoestável, dNTPs e primers.

Em seguida, adicione sondas de oligonucleotídeos específicos do alelo - marcadas com repórteres de fluorescência de cores diferentes para distinguir entre os alelos - e uma molécula de atenuador. A proximidade do supressor com o repórter suprime sua fluorescência.

Divida a solução nas câmaras de reação de um chip microfluídico. Cada câmara contendo um alelo serve como um recipiente de reação independente.

Coloque o tubo com o chip dentro de um termociclador e inicie a reação. Em alta temperatura, o DNA de fita dupla se desnatura em fitas simples. Abaixe a temperatura para recozer os primers e as sondas de oligonucleotídeos em suas regiões complementares.

A uma temperatura de extensão apropriada, a DNA polimerase estende os primers e cliva a sonda. A distância do extintor permite a emissão de fluorescência do repórter.

Leia os sinais de fluorescência de cores diferentes e crie um gráfico de posição para detectar as câmaras que contêm os alelos.

Para determinar a frequência do alelo mutante - a fração do alelo variante - calcule a proporção de câmaras contendo o alelo mutante versus o alelo do tipo selvagem.

Adicione primers, sondas e DNA genômico previamente projetados a uma nova tira de 8 tubos, para obter um volume total de 15 microlitros. Pipete para cima e para baixo para misturar.

Adicione a plataforma de carregamento aos cavacos construídos na nova tira de 8 tubos e, em seguida, coloque a tira de tubos no carregador automático. Certifique-se de que haja um contato entre os cavacos e a plataforma de carregamento. Em seguida, coloque o controle deslizante de carregamento na plataforma e use uma rolha para segurar o controle deslizante fora do carregador. Pipete 15 microlitros da mistura de PCR perto da ponta do controle deslizante e, em seguida, pressione o botão do carregador para operar o carregador por 1 minuto.

Remova a tira de tubo da carregadeira após a execução e coloque-a no intensificador de vedação. Empurre cuidadosamente a tampa deslizante e a borda da tampa superior. Execute o intensificador de vedação por aproximadamente 2 minutos. Se a vedação estiver incompleta, indicada por uma poça de líquido, repita a corrida por mais um minuto.

Adicione 230 microlitros de fluido de vedação aos tubos. Coloque a tira de tubo no termociclador e execute a PCR conforme descrito no protocolo. Se houver uma distribuição desigual de partições positivas, ajuste a temperatura ou a duração da PCR.

Para detectar e analisar a intensidade de fluorescência dos produtos de PCR, coloque a tira de tubo no gabarito de detecção e adicione 6 mililitros de água destilada. Remova quaisquer bolhas de ar visíveis usando uma ponta de pipeta.

Carregue o gabarito no detector. No software de detecção, selecione as guias "Fluorescência", "Experimento" e depois "Amostra/NTC" e clique no botão "Executar" para iniciar a execução. Após a execução completa, confirme o gráfico de posição, o histograma e o gráfico de dispersão 2D.

Para coletar o produto de PCR, remova o fluido de vedação do tubo. Adicione 100 microlitros de tampão TE e vortex vigorosamente por 30 segundos. Centrifugue brevemente os tubos em uma centrífuga de mesa e proceda conforme descrito no protocolo de texto, para concluir a coleta do produto de PCR.