Name: Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a usar anisotropia de fluorescência para quantificar interações proteína-proteína entre SBDS e EFL1. Esta técnica fornece dados quantitativos e qualitativos essenciais para estudos de bioquímica e biofísica celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem o apoio financeiro dos projetos CONACyT números 167359 e 177138, e do projeto número IN201615 da DGAPA-UNAM.

1. SBDS-flash Expressão Tag e purificação de proteínas NOTA: Para as experiências de anisotropia, uma FLASH-tag que corresponde à sequência Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys foram adicionados ao C-terminal da sequência de codificação SBDS humanos por PCR. Esta construção foi subclonado no vector de expressão pRSET-A e transformada em células C41 de Escherichia coli para expressar uma proteína que codifica uma etiqueta de hexa-histidina N-terminal (His-tag), as SBDS humanos e uma sequência C-terminal 10 Flash tag de codificação. <ol><li> A expressão da proteína SBDS-flash <ol><li> Transformar E. competente coli C41 com o plasmídeo pRSET-HisSBDS-flash usando um protocolo de choque térmico padrão de 19. Placa as células em meios sólidos Luria-Bertani (LB) suplementado com 100 ug / ml de ampicilina. LB composição meio sólido consiste em 10 g de NaCl, 5 g de extracto de levedura, 10 g de triptona e 20 g de agar para o volume de 1 litro. </li><li> Culturas de bactérias transformadas a 37 ° C atéabsorvância a 600 nm (A 600) atinge 0,5-0,7 em 1 L de meio líquido LB suplementado com 100 ug / ml de ampicilina. </li><li> Induzir a expressão da proteína por adição de 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido para a cultura e a incubação continua durante mais 5 h. </li><li> Recolha a suspensão bacteriana por centrifugação a 3800 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante. Neste ponto, quer armazenar o sedimento de células à temperatura de -20 ° C ou utilizar imediatamente para purificação de proteínas. </li></ol></li><li> Purificação de proteínas SBDS-flash NOTA: Todos os passos cromatográficos são realizadas utilizando um sistema de cromatografia líquida (FPLC) de proteína rápida ou uma bomba peristáltica. Cromatografia em Ni 2+ -affinity usa uma coluna de fluxo rápido de 5 ml. cromatografia de troca aniônica usa um 5 ml forte coluna de permutador de sulfopropil cação. Uma taxa de fluxo de 3 ml / min foi usado para todos os passos cromatográficos. <ol><li> Ressuspender as células em 35 ml de lise b SBDSpode ser prejudicado (tampão fosfato 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) suplementado com fluoreto de 1 mM de fenilmetilsulfonilo (PMSF) e lise por sonicação durante um tempo total de 4 minutos com ciclos de 10 segundos ligado e 30 segundos desligado, a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a amostra a 9000 xg durante 50 min a 4 ° C. </li><li> Manter o sobrenadante e descartar o sedimento para remover os restos celulares. </li><li> Equilibrar a coluna de afinidade de Ni 2+ com 3 volumes de coluna (CV) de tampão de lise e SBDS introduzir a totalidade clarificada sobrenadante na coluna. </li><li> Remover a proteína não ligada por meio de lavagem com 3 CV de tampão de lise SBDS e eluir com 3 CV de tampão de eluição SBDS (tampão fosfato 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM). </li><li> Dilui-se a proteína 6 vezes eluída com tampão fosfato 50 mM pH 6,5 e remover possíveis agregados por filtração através de uma membrana de celulose de 0,22 um. </li><li> Equilibrar a coluna sulfopropil cátion trocador com 3 CV de baixo teor de sal coluna Stampão (tampão de fosfato 50 mM pH 6,5, NaCl 50 mM) e introduzir a amostra de proteína a partir do passo anterior. </li><li> Lave o material não ligado com 3 CV de tampão de baixo teor de sal coluna de S e elui-se a proteína num único passo, com tampão de fosfato 50 mM pH 6,5, NaCl 1 M. </li><li> Dilui-se a proteína de 3,3 vezes eluída com tampão fosfato 50 mM de pH 6,5. Concentra-se a proteína com dispositivos de ultraf iltração por centrifugação a 3800 xg durante 15 min. Flash congelar a proteína em azoto líquido e armazená-lo a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Verifique a pureza da proteína por análise de SDS-PAGE e coloração com Coomassie 20. </li></ol></li></ol> 2. EFL1 Protein Expression and Purification NOTA: EFL1 foi expressa sob a regulação da Gal 1/10 promotor divergente 21 e o Saccharomyces cerevisiae MAT A 3&#39;UTR no pRS426 vetor. A proteína recombinante codifica a isoforma humana EFL1 1 fundido com uma protease de vírus do tabaco Etch (TEV) local de reconhecimento e um tag de hexa-histidina na extremidade C-terminal. <ol><li> A expressão da proteína EFL1 <ol><li> Transformar S. células cerevisiae BCY123 com o plasmídeo pRS426-EFL1TevHis utilizando um protocolo de acetato de lítio padrão 22. Placa todas as células transformadas em queda para fora sintético sem uracilo meios (SD-URA) suplementado com 2% (w / v) de glucose. Composição dos meios SD-URA consiste de 8 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, casaminoácidos 11 g, 55 mg de sulfato de adenina, 55 mg de tirosina, leucina 60 mg e 60 mg de triptofano para o volume de 1 litro. </li><li> Cultura de levedura transformadas a 30 ° C até 600 um atinge 1,8 em 1 L de meio SD-URA suplementado com 0,5% (w / v) de glucose. </li><li> Induzir a expressão da proteína por adição de 2,8% de galactose (v / w) para a cultura e a incubação continua durante mais 18 h a 30 ° C. </li><li> Recolha a suspensão de levedura por centrifugação a 3800 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante.Neste ponto, quer armazenar o sedimento de células à temperatura de -20 ° C ou utilizar imediatamente para purificação de proteínas. </li></ol></li><li> Purificação de proteínas EFL1 NOTA: Todos os passos cromatográficos são realizadas utilizando um sistema de FPLC ou de uma bomba peristáltica. Cromatografia em Ni 2+ -affinity usa uma coluna de fluxo rápido de 5 mL a uma taxa de fluxo de 3 mL / min. A cromatografia de exclusão de tamanho usa uma coluna de 125 ml de pré-embalada com resina Superdex 200 com um caudal de 1 ml / min. <ol><li> Ressuspender as células em 50 ml de EFL1 tampão de lise (Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, MgCl 5 2, 10% glicerol) suplementado com PMSF 1 mM e benzamidina 1 mM e à dissociação das células por atrito sobre um batedor de grânulo usando esferas de vidro (o = 0,5 mm) durante um tempo total de 6 min, utilizando ciclos de 2 minutos a 15 minutos e DESLIGADO, a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a amostra a 9000 xg durante 50 min a 4 ° C. </li><li> Manter o sobrenadante e descartar o sedimento para remover os restos celulares. </li&gt; <li> Equilibrar a coluna de afinidade de Ni 2+ com 3 CV de tampão de lise e EFL1 introduzir todo o sobrenadante clarificado numa coluna. </li><li> Remover a proteína não ligada por meio de lavagem com 3 CV de tampão de lise EFL1 e eluir com 3 CV de tampão de eluição EFL1 (50 mM de Tris-HCl a pH 8, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM, MgCl 2 5, 10% de glicerol). </li><li> Equilibrar a coluna de exclusão de tamanho, com 1,5 VC de tampão de anisotropia (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, MgCl 2 5, 10% de glicerol, 5 mM de β-mercaptoetanol). </li><li> Concentra-se a 1 ml da proteína EFL1 eluído a partir da coluna de afinidade de Ni 2+ com dispositivos de ultraf iltração por centrifugação a 3800 xg para o volume desejado. Introduzir a amostra na coluna de exclusão de tamanho. </li><li> Recolha a proteína eluida e concentra-se por ultrafiltração até uma concentração final de cerca de 30 uM. Flash congelar a proteína em azoto líquido e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. Verifique the pureza da proteína por análise de SDS-PAGE e coloração com Coomassie 20. </li></ol></li></ol> 3. Rotulagem de SBDS-flash com o flash corante fluorescente 4 &#39;, 5&#39;-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) Fluoresceína <ol><li> Misturar 3 nmol de proteína SBDS-flash com 3 nmol do 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) corante f luoresceína em volume de 5 ul de tampão de anisotropia. </li><li> Deixe a reacção prosseguir durante 8 horas a 4 ° C. Diálise da amostra contra tampão Anisotropy durante a noite para remover o corante livre. </li><li> Usar a lei de Lambert-Beer para quantificar a% de proteína marcada. Medir a absorvância a 280 nm e 508 nm num espectrofotómetro usando uma cuveta de quartzo de volume apropriado. NOTA: Considere os seguintes coeficientes de absorção molar (M -1 cm -1): <img alt="Equation1B" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1B.jpg" /></li><li> Calcular a concentração de proteína SBDS-flash marcado usando a Equação 2. <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq2.jpg" /></li><li> Calcular a concentração de proteína total SBDS usando a Equação 3, substituindo o calculado C SBDS-flash a partir do passo anterior. <img alt="Equation3" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq3.jpg" /></li><li> Calcular a percentagem de proteína marcada usando a Equação 4. <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq4.jpg" /></li></ol> 4. Experiências de Anisotropia de fluorescência NOTA: Anisotropia experiências foram feitas em um espectros luorómetro equipado com uma caixa de ferramentas de polarização e recolha de dados foi realizada utilizando o programa de anisotropia fornecida no software do equipamento. O comprimento de onda de excitação foi fixado em 494 nm com uma largura de banda espectral de 8 nm e a emissão foi registada utilizando um filtro passa-banda de 530 ± 25 nm. As medições foram realizadas a 25 ° C em 200 ul de uma cuvete com um comprimento do percurso 10 5 milímetros. <ol><li><html> Em uma tina de fluorescência, coloque 200 mL de 30 nm SBDS flashes em tampão anisotropia e titular 2 ul de EFL1 30? M. Misture bem e deixe a reacção repousar durante 3 min antes de medir o valor de anisotropia. </li><li> Repetir o passo 4.1 até um volume total de 40 ul de EFL1 foi adicionado. </li></ol> Análise 5. Os dados <ol><li> Ajustar os dados para o modelo de encadernação adequada usando um algoritmo de regressão por mínimos quadrados não-linear. As equações para os modelos mais comuns de ligação são apresentados na Tabela 1. </li><li> Avaliar o melhor modelo que descreve a interação entre as proteínas inspecionando os resíduos do ajuste 23. Apoiar o modelo escolhido com experimentos adicionais. </li></ol> Tabela 1. Modelos de ligação comum de interação proteína-proteína e as equações matemáticas que os descrevem.0 / 54640table1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela. <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640table1.jpg" />

<ol><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li>
<li>Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+of+protein-fragment+complementation+assays+for+studying+and+dissecting+large-scale+and+dynamic+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).</li>
<li>Snider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+protein+interaction+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of protein interaction network mapping.</a> Mol Syst Biol. 11 (12), 848(2015).</li>
<li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFersht%2C+A+%22Structure+and+mechanism+in+protein+science%3A+a+guide+to+enzyme+catalysis+and+protein+folding%22">Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding</a>. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).</li>
<li>Menne, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shwachman-Bodian-Diamond+syndrome+protein+mediates+translational+activation+of+ribosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast.</a> Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).</li>
<li>Boocock, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+SBDS+are+associated+with+Shwachman-Diamond+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome.</a> Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).</li>
<li>Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Guanine+Nucleotide+Exchange+in+the+Elongation+Factor-like+1+%28EFL1%29+GTPase+by+Mutations+in+the+Shwachman-Diamond+Syndrome+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein.</a> J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).</li>
<li>Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanine+nucleotide+exchange+in+the+ribosomal+GTPase+EFL1+is+modulated+by+the+protein+mutated+in+the+Shwachman-Diamond+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy%22">Principles of fluorescence spectroscopy</a>. , Third, Springer US. (2010).</li>
<li>Nishigaki, T., Treviño, C. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNishigaki%2C+T+%22Tools+to+understand+protein-protein+interactions%22">Tools to understand protein-protein interactions</a>. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).</li>
<li>Johnson, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+I+%22The+Molecular+Probes+Handbook%3A+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).</li>
<li>Sabnis, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSabnis%2C+RW+%22Handbook+of+Fluorescent+Dyes+and+Probes%22">Handbook of Fluorescent Dyes and Probes</a>. , Wiley. (2015).</li>
<li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications.</a> J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li>
<li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281 (5374), 269-272 (1998).</li>
<li>Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+labeling+of+proteins%3A+techniques+and+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches.</a> Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li>
<li>West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL1-GAL10+divergent+promoter+region+of+Saccharomyces+cerevisiae+contains+negative+control+elements+in+addition+to+functionally+separate+and+possibly+overlapping+upstream+activating+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences.</a> Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).</li>
<li>Eftink, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+methods+for+studying+equilibrium+macromolecule-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions.</a> Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Substrates+to+the+Central+Pore+of+the+Vps4+ATPase+Is+Autoinhibited+by+the+Microtubule+Interacting+and+Trafficking+%28MIT%29+Domain+and+Activated+by+MIT+Interacting+Motifs+%28MIMs%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs).</a> J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).</li>
<li>Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+natively+unfolded+HIF-1alpha+ODD+domain+to+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53.</a> Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).</li>
<li>Trusch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Region+of+the+Ubiquitin+Regulatory+X+%28UBX%29+Domain-containing+Protein+1+%28UBXD1%29+Modulates+Interdomain+Communication+within+the+Valosin-containing+Protein+p97%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97.</a> J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).</li>
<li>Kamp, F., Beyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+alpha-synuclein+affects+the+lipid+packing+in+bilayers+of+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemsitry%22%5BJournal%5D)">Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles.</a> The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).</li>
<li>Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Intensity%2C+Anisotropy%2C+and+Transient+Dynamic+Quenching+Stopped-Flow+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Spectroscopic+Methods+of+Analysis%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics.</a> Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).</li>
<li>Asano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+between+EFL1+and+SBDS+is+mediated+by+an+intrinsically+disordered+insertion+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain.</a> Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar e não têm interesses financeiros concorrentes.

A maioria das experiências bioquímicas com proteínas requerem não só proteína pura, mas também uma grande quantidade deles, independentemente da técnica utilizada. Por esta razão, as proteínas utilizadas para este tipo de experiências são obtidos por expressão heteróloga, como era o caso aqui apresentado. espectroscopia de fluorescência requer a presença de um fluoróforo na molécula estudada. resíduos aromáticos constituem os fluoróforos intrínsecas de uma proteína, no entanto, utilizando o seu sinal para estudar as int...

As células contêm um grande número de biomacromoléculas constantemente que interagem uns com os outros. Esta associação dá origem a complexos que participam nas vias celulares responsáveis ​​para o seu funcionamento na transdução de sinal, a regulação da expressão do gene e a migração de células, entre outros. Todas as interacções proteína-proteína que ocorrem numa célula compreendem uma rede conhecida como a interactoma. Em Saccharomyces cerevisiae foram mostrados mais do que 70% das suas proteínas de ter parceiros interactuantes 1. Compreender o interactome de uma célula e suas funções fornecem informações relevantes sobre a complexidade e diversidade dos organismos vivos. Várias metodologias têm sido descritos para identificar e caracterizar as interacções proteína-proteína. Diferente alta através de métodos colocados como a levedura de dois híbridos 2, ensaios de complementação de proteína-fragmento de 3, 4 purificação por afinidade acoplada a espectrometria de massa e microarra proteínays são utilizados para identificar uma interacção 5,6. Uma vez identificado, é necessário para a sua validação e pode variar numa base de caso-a-caso. Tipicamente, estas experiências envolvem interromper a interacção si ao nível dos membros individuais do par de interacção, por exemplo, por deleção do gene ou a superexpressão de uma das proteínas, e, em seguida, à procura de mudanças nas propriedades ou a função do outro membro do nível celular. Subsequentemente, as técnicas biofísicas 7 são usados para caracterizar a interacção proteína-proteína, a nível molecular. Para este fim, a estrutura dos complexos de proteína são determinadas por cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear e microscopia crio-electrões enquanto calorimetria e espectroscopia de fluorescência são usadas para quantitativamente e mecanisticamente os descrever. Neste trabalho, Anisotropia de fluorescência foi usada como uma técnica para caracterizar a interacção entre a GTPase EFL1 e SBDproteína S. Estas proteínas participam na síntese de ribossomas, promovendo a libertação do factor de iniciação eucariótico 6 a partir da superfície das subunidade ribossomal 60S 8. A proteína SBDS está mutado em uma doença conhecida como síndrome de Shwachman- diamante 9 e actua como um factor de troca do nucleótido guanina para EFL1 diminuindo a sua afinidade para o difosfato de guanosina 10,11. mutações doença em SBDS abolir a interação com EFL1 e, assim, evitar a sua activação. Anisotropia de fluorescência é comumente utilizado em aplicações biológicas para estudar proteína-péptido ou interacções proteína-ácido nucleico. Baseia-se no princípio de que um fluoróforo excitado com resultados de luz polarizada em uma emissão parcialmente polarizado. anisotropia de fluorescência é definido pela Equação 1: <img alt="equação1" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1.jpg" /> onde VV e VH são osintensidades de fluorescência da vertical (VV) e horizontal (VH) polarizado emissão quando a amostra está animado com verticalmente luz polarizada 12. Anisotropia de fluorescência é sensível a factores que afectam a taxa de difusão de rotação do fluororo e, portanto, depende da temperatura, da viscosidade da solução e o tamanho molecular aparente do fluoróforo. O tamanho aparente de uma proteína que contém um fluoróforo aumenta quando ele interage com uma outra proteína e em seguida, tal mudança pode ser avaliada como uma alteração na anisotropia. Mais especificamente, um fluoróforo, que roda lentamente em solução em relação ao seu tempo de vida de fluorescência terá um grande valor I VV e o valor pequeno I VH e, por conseguinte, irá apresentar uma relativamente grande anisotropia. Para fluoróforos que caem rapidamente em relação ao seu tempo de vida de fluorescência, eu VV e VH I será semelhante eo seu valor de anisotropia será pequeno 12 </sup&gt; (Figura 1). Além disso, para um bom sinal de anisotropia para medição de ruído, é necessário ter um fluoróforo com um tempo de vida de fluorescência similar ao tempo de correlação rotacional da molécula de interesse. Caso contrário, não é possível registar com precisão a diferença de anisotropia entre a proteína livre e que, no complexo. Por exemplo, a anisotropia de uma sonda fluorescente, com um tempo de vida perto de 4 ns, tais como fluoresceína ou rodamina ligados a um composto de baixo peso molecular de 100 Da é 0,05. A ligação a uma molécula de 160 kDa vai aumentar o seu valor de anisotropia de 0,29; uma diferença que pode ser medido com precisão. Em contraste, a mesma sonda fluorescente envolvido numa reacção de ligação cuja aumento no tamanho molecular varia de 65 a 1000 kDa só vai resultar numa alteração de anisotropia de 0,28 a 0,3, o que é demasiado pequeno para ser medido com precisão. Neste cenário, uma sonda com uma vida útil de 400 nanossegundos seria mais adequado 12. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640fig1.jpg" /> Figura 1. Representação esquemática do equipamento utilizado para medir a anisotropia de fluorescência e o procedimento. Representação esquemática do equipamento utilizado para realizar uma medição de fluorescência anisotropia experimento interacção proteína-proteína. Fluoróforos que caem rápido pequena anisotropia de exibição que aumenta após ligação a um parceiro de interação. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> aplicações de fluorescência requerem a presença de um fluoróforo em qualquer uma das moléculas estudadas. Para estudar as interacções proteína-proteína, existem três tipos de fluoróforos: 1) os resíduos de triptofano presentes nas proteínas, 2) fluoróforos ligados quimicamente e 3) parceiros de fusão fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde (GFP) e a sua derivativas. A maioria das proteínas têm resíduos de triptofano na sua estrutura, portanto, a forma mais fácil de medir uma interacção é através da monitorização das alterações na espectros de fluorescência correspondente ou por monitorização das alterações na intensidade de fluorescência dos resíduos de triptofano. No entanto, os resíduos de triptofano podem estar presentes em ambas as proteínas que complicam a análise. Por outro lado, para um fluoróforo para alterar as suas propriedades fluorescentes, devido a uma interacção precisa de ser localizado em ou perto do local de ligação e que poderia interferir com a própria interacção. Este precisa de atenção especial quando se utiliza fluoróforos volumosos, como GFP. Se nenhum destes fluoróforos podem ser utilizados para estudos de ligação é necessário, em seguida, introduzir fluoróforos extrínsecos ao uma das proteínas envolvidas. Existem muitos fluoróforos quimicamente sintetizados e podem ser ligados covalentemente a proteínas através dos seus grupos reactivos tais como os grupos amina da cadeia lateral (de lisinas ou no terminal N) e os grupos tiol na cisteína. Fderivados luorophore com ésteres de succinimidilo e isotiocianato de reagir com grupos de amida, enquanto a iodoacetamida e maleimida são grupos 13-tiol reactivos. Os corantes mais comuns usados ​​em aplicações de fluorescência são derivados da fluoresceína e rodamina os corantes verdes, cumarinas, e corantes BODIPY fluoróforos Alexa Fluor. Uma lista detalhada de fluoróforos disponíveis comercialmente e a sua utilização pode ser encontrada em referências 14,15. Para a marcação com êxito, o grupo reactivo deve ser expostos na superfície da proteína, mas, devido ao grande número de grupos funcionais reactivos, tipicamente presentes em polipéptidos, é muito difícil conseguir a modificação específica do local. A proteína de interesse neste estudo, SBDS, contém 5 cisteínas livres e 33 lisinas que podem resultar na marcação de vários sites. rotulagem não uniforme pode afectar a ligação e vai complicar a análise de dados como moléculas fluoróforo diferentes podem provocar diferentes sinais de intensidade de fluorescência após a ligação. para overcome esse problema, foi utilizado o fluoróforo flash, 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína com o selo de site direto da proteína SBDS. Este é um corante arsenoxide com uma elevada afinidade para quatro cisteínas espaçadas num motivo conhecido como FLASH-tag que consiste na sequência de CCXXCC onde X é qualquer aminoácido excepto cisteína 16,17. Este motivo tetracisteï¿½a é adicionado à extremidade N ou C-terminal da proteína através da engenharia genética juntamente com um ligante apropriado para evitar o rompimento da dobragem global da proteína. O par constituído por corante flash e-tag foi originalmente concebido para proteínas de etiquetas específicas do local em células 17 que vivem, mas também pode ser usado para rotular proteínas purificadas in vitro, como é exemplificado aqui. Além disso, as estratégias enzimáticas também têm sido desenvolvidos para permitir a funcionalização do local específico de proteínas 18. Nesse artigo, procuramos descrever a utilidade da fluorescência anisotropia umferramenta sa para estudar as interações proteína-proteína. A ligação pode ser avaliada através de uma simples inspecção da forma da curva de ligação enquanto que a informação quantitativa pode ser obtida a partir do ajuste dos dados experimentais.

<table><tbody><tr><td>Contas de vidro de 0,5 mm</td><td>Produtos Biospec</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Para Médio</td><td>TRIS01</td><td>Corante ultra puro</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolano-2-il) fluoresceína</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>LC6090</td><td>Este kit contém o corante para rotular uma etiqueta FlAsH</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB02040</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glicose Anidra</td><td>Para Meio</td><td>GLU03</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Galactose</td><td>Para Meio</td><td>GAL03</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Para</td><td>Meio DOC0157</td><td></td></tr><tr><td>L-Triptofano&nbsp;</td><td>Para hidrocloro</td><td>de</td> bezamidina DOC0189 <td></td>médio</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-5G</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Gold Biotechnology, Inc</td><td>P-470-25</td><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonil</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Para cloreto</td> de sódio <td>NAC02</td><td>para médio&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Tecsiquim, S.A. de C.V.</td><td>GT1980-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>1725711000</td><td>Cloreto de Magnésio</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Fosfato de potássio dibásico</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139-500G</td><td>Fosfato de sódio monobásico</td></tr><tr><td>Base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Formedium</td><td>YEM03</td><td>Micro Granulated</td></tr><tr><td>L-Tyroisne</td><td>Formedium</td><td>DOC0193</td><td></td></tr><tr><td>sulfato</td> <td>de adeninaPara médio</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos Casamino</td><td>Para médio</td><td>CAS03</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB49182</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Para médio</td><td>IPTG025</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtração</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>UFC901096</td><td>Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10&nbsp; Filtro de Membrana kDa</td></tr><tr><td></td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>GSWP04700</td><td>Filtro de Membrana, ésteres de celulose mistos, Hidrofílico, 0.22&nbsp; &micro; m, 47&nbsp; mm, branco, liso</td></tr><tr><td>Ni2+ coluna de afinidade</td><td>QIAGEN</td><td>30760</td><td>Cartucho pré-preenchido com 5&nbsp; ml Coluna de</td></tr><tr><td>trocador de cátions de sulfopropil forte</td> Ni-NTA <td>Superflow GE Healthcare Life Science</td><td>17-5157-01</td><td>HiTrap SP Sepharose FF 5 ml</td></tr><tr><td>Coluna de exclusão de tamanho</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>Célula de fluorescência</td><td>Hellma Analytics</td><td>111-057-40</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6860AA</td><td>Agitador UV-Vis Cary 60</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>SHKA4000-7</td><td>MaxQ 4000 Faixa de temperatura de bancada Ambiente-15&deg; a 60&deg; </td></tr><tr><td>C Centrífuga</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004271</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td></tr><tr><td>FPLC</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>Sistema FPLC descontinuado</td><td>condutividade Monitor UV-MM II P500 fração da bomba</td></tr><tr><td>Espectrofluorômetro</td><td>Olis</td><td>Não aplicável</td><td>Olis DM 45 com caixa de ferramentas de polarização</td></tr></tbody></table>

anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

interacções proteína-proteína desempenham um papel fundamental na função de um organismo vivo. Uma vez que uma interacção tem sido identificadas e validadas, é necessário caracterizar-la ao nível estrutural e mecânica. Existem vários métodos bioquímicas e biofísicas para tal finalidade. Entre eles, Anisotropia de fluorescência é uma técnica poderosa particularmente utilizado quando a intensidade de fluorescência de uma proteína marcada com fluoróforo permanece constante após a interacção proteína-proteína. Nesta técnica, uma proteína marcado com fluoróforo é animado com luz polarizada verticalmente de um comprimento de onda apropriado que excita selectivamente um subconjunto dos fluoróforos de acordo com a sua orientação em relação com o feixe de entrada. A emissão resultante também tem uma direcionalidade cujo relacionamento nos planos vertical e horizontal define anisotropia (r) como segue: r = (I VV -I VH) / (I VV + 2I VH), onde eu VV e eu <sUB&gt; VH são as intensidades de fluorescência das componentes verticais e horizontais, respectivamente. Anisotropia de fluorescência é sensível à difusão de rotação de um fluoróforo, ou seja, o tamanho molecular aparente de um fluoróforo ligado a uma proteína, que é alterado por interacção proteína-proteína. No presente texto, a utilização da anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interacções proteína-proteína foi exemplificado para tratar a ligação entre a proteína mutada na Síndrome Shwachman- diamante (SBDS) e o factor de alongamento como-1 GTPase (EFL1). Convencionalmente, a etiquetagem de uma proteína com um fluoróforo é realizada sobre os grupos tiol (cistea) ou nos grupos amino (a amina N-terminal ou da lisina) da proteína. No entanto, SBDS possui várias cisteínas e lisinas que não permitiam site de rotulagem dirigido dele. Como uma técnica alternativa, o corante de 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína foi utilizado para marcar especificamente um motivo tetracisteï¿½a, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, geneticamente modificada no terminal C da proteína recombinante SBDS. Montagem dos dados experimentais fornecida informação quantitativa e mecanística sobre o modo de ligação entre estas proteínas.

Para realizar qualquer experiência anisotropia é importante para descartar grandes mudanças na intensidade de fluorescência do fluoróforo uma vez que a anisotropia observada de uma mistura de espécies é representado pela Equação 5: <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq5.jpg" /> onde F i representa a fluorescência fraccionada de ...

interações proteína estão no cerne da função de uma célula. calorimétrica técnicas espectroscópicas e são vulgarmente utilizados para os caracterizar. Aqui, descrevemos a anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar a interacção entre a proteína mutada na Síndrome Shwachman- diamante (SBDS) e o factor de alongamento como uma GTPase (EFL1).

Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

O objetivo geral deste experimento é avaliar e quantificar a interação entre duas proteínas de interesse utilizando Anisotropia de Fluorescência. Essas medidas podem ajudar a responder perguntas fundamentais na área de bioquímica e biofísica de proteínas, como quais interações proteicas são importantes para a função celular.A principal vantagem desta técnica é que podemos obter informações quantitativas e qualitativas sobre a interação proteína-proteína. Para preparar a proteína SBDS-FlAsH purificada, prepare primeiro um litro de meio líquido LB suplementado com 100 microgramas por mililitro de ampicilina. E nele, cultive bactérias transformadas a 37 graus Celsius até que a densidade óptica em 600 nanômetros atinja de 0,5 a 0,7.Induza a expressão da proteína SBDS-FlAsH adicionando 0,5 milimolar de IPTG ao cultivo e continue a incubação por mais cinco horas. Em seguida, colete a suspensão bacteriana por centrifugação a 3800 × g durante dez minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante.Re-suspenda as células em 35 mililitros de tampão de lise SBDS suplementado com um milimolar de PMSF. Lise por sonicação por um tempo total de quatro minutos, utilizando ciclos de dez segundos ligados e 30 segundos desligados a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue a amostra a 9.000 × g por 50 minutos a quatro graus Celsius.Mantenha o sobrenatante e descarte o pellet para remover os detritos celulares. Após a equilibração da coluna de afinidade com níquel com três volumes da coluna do tampão de lise SBDS, aplique todo o sobrenatante clarificado na coluna. Remova as proteínas não ligadas lavando com três volumes da coluna do tampão de lise SBDS.Após a lavagem da coluna, elua a proteína ligada com três volumes de coluna do tampão de eluição SBDS. Para purificar ainda mais a proteína, equilibre a coluna de troca catiônica sulfopropila com três volumes de coluna do tampão S de baixo sal. Dilua a proteína seis vezes com tampão fosfato 50 milimolar pH 6,5 e introduza-a na coluna.Lave o material não ligado com três volumes da coluna do tampão de baixa salinidade para coluna S. Em seguida, elua a proteína em um único passo adicionando tampão fosfato 50 milimolar, pH 6,5, contendo cloreto de sódio 1 molar à coluna. Dilua o eluato em três vezes com tampão fosfato 50 milimolar, pH 6,5.Em seguida, concentre a proteína utilizando dispositivos de ultrafiltração por centrifugação a 3800 × g durante quinze minutos. A qualidade das proteínas utilizadas neste tipo de experimento é muito importante. A interpretação dos dados torna-se complicada se as amostras de proteína utilizadas não forem de alta pureza.Verifique a pureza da proteína SBDS-FlAsH por meio de análise de SDS-PAGE e coloração com Coomassie. Congele rapidamente a proteína em nitrogênio líquido e armazene-a a menos 80 graus Celsius até uso posterior. Para preparar a proteína EFL1 purificada, cultive primeiro levedura transformada a 30 graus Celsius em um litro de meio sintético de eliminação sem uracila, suplementado com 0,5 por cento de glicose, até que a densidade óptica em 600 nanômetros atinja 1,8.Induza a expressão proteica adicionando 2,8 por cento de galactose ao cultivo e continue a incubação por 18 horas a 30 graus Celsius. Colete a suspensão de levedura por centrifugação a 3800 × g durante dez minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante após a centrifugação.Re-suspenda as células em 50 mililitros de tampão de lise EFL1 suplementado com um milimolar de PMSF e um milimolar de benzamidina. Rompa as células por fricção em um homogeneizador de esferas usando esferas de vidro por um tempo total de seis minutos, utilizando ciclos de dois minutos ligado e quinze minutos desligado a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue a amostra a 9.000 ×g por 50 minutos a quatro graus Celsius.Mantenha o sobrenatante e descarte o pellet para remover os detritos celulares. Em seguida, equilibre a coluna de afinidade por níquel com três volumes da coluna do tampão de lise EFL1. Aplique todo o sobrenatante clarificado na coluna equilibrada.Após remover a proteína não ligada lavando a coluna com três volumes de coluna do tampão de lise EFL1, elua a proteína ligada com três volumes de coluna do tampão de eluição EFL1. Para purificar ainda mais a proteína EFL1, equilibre a coluna de exclusão por tamanho com 1,5 volumes de coluna do tampão de Anisotropia. Concentre a proteína EFL1 eluída da coluna de afinidade por níquel até um mililitro utilizando dispositivos de ultrafiltração por centrifugação a 3800 vezes G. Em seguida, introduza a amostra concentrada na coluna de exclusão por tamanho.Colete a proteína eluída e concentre por ultrafiltração até uma concentração final de aproximadamente 30 micromolar. Verifique a pureza da proteína EFL1 por meio de análise de SDS-PAGE e coloração com Coomassie. Congele rapidamente a proteína em nitrogênio líquido e armazene a menos 80 graus Celsius até uso posterior.Misture três nanomols da proteína SBDS-FlAsH com três nanomols do corante lumio verde em um volume de cinco microlitros de tampão de anisotropia. Deixe a reação prosseguir por oito horas a quatro graus Celsius. Após oito horas, diализar a amostra contra o tampão de anisotropia durante a noite para remover o corante livre.Meça as absorbâncias a 280 nanômetros e 508 nanômetros em um espectrofotômetro utilizando uma cubeta de quartzo. Em seguida, utilize a Lei de Lambert-Beer para quantificar a porcentagem de proteína marcada conforme descrito no protocolo do texto. Antes de medir o valor de anisotropia, cada etapa de filtração proveniente da legião proteica deve ser realizada com cuidado, garantindo que toda a amostra seja dispensada na solução e se torne homogênea.Em uma cubeta de fluorescência, coloque 200 microlitros de SBDS-FlAsH 30 nanomolar em tampão de anisotropia e realize uma titulação com dois microlitros de EFL1 30 micromolar. Misture bem e deixe a reação em repouso por três minutos antes de medir os valores de anisotropia e fluorescência. Repita este processo até que um volume total de 40 microlitros de EFL1 tenha sido adicionado.Como etapa final, ajuste os dados a um modelo de ligação presumido conforme descrito no protocolo do texto. Para realizar qualquer experimento de anisotropia, é importante descartar grandes alterações na intensidade de fluorescência. Como mostrado aqui, a fluorescência do SBDS-FlAsH não muda significativamente após ligação ao EFL1.A titulação de EFL1 em uma cubeta de quartzo contendo SBDS-FlAsH resulta em um aumento da anisotropia observada inicialmente. Várias adições de EFL1 descrevem a curva de ligação correspondente, que pode ser ajustada por meio de regressão não linear de mínimos quadrados a um modelo de ligação presumido. Neste caso, um modelo de um único sítio de ligação não descreve adequadamente os dados experimentais.Em vez disso, um modelo com dois sítios de ligação não idênticos descreve adequadamente os dados experimentais. Uma vez dominado, o experimento de ligação por anisotropia de fluorescência pode ser realizado em três horas, se for executado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante ter proteína purificada em grandes quantidades.Paralelamente a este procedimento, outros métodos como o ensaio de complementação baseado em fragmentos ou a anisotropia de fluorescência com diferentes domínios da proteína estudada podem ser realizados para apoiar o modelo de ligação apropriado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um experimento de ligação seguido de anisotropia de fluorescência.

fluorescence-anisotropy-as-tool-to-study-protein-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo descreve como imagem de interações proteína-proteína através de um ensaio de proximidade FRET-based.

Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Este vídeo demonstra o uso da espectroscopia de flutuação de fluorescência para detectar a interação entre as proteínas da superfície celular nos contatos célula-célula. Ao expressar o receptor de adesão transmembrana de interesse marcado com uma proteína fluorescente e misturar duas populações de células diferentes que abrigam dois marcadores fluorescentes separados espectralmente, a transinteração entre os receptores de duas células vizinhas com fluorescência de cores diferentes é avaliada...

Espectroscopia de Flutuação de Fluorescência para Estudar a Interação de Proteínas em Contatos Celulares

Este vídeo demonstra a técnica de espectroscopia de flutuação de fluorescência (FFS) para estudar a homo-oligomerização de proteínas. As proteínas marcadas com fluorescência em uma amostra são dimerizadas usando um agente ao estudar a oligomerização de proteínas usando FFS. Usando um microscópio confocal, à medida que as proteínas se movem para dentro e para fora do pequeno volume de observação, a análise das flutuações no brilho das moléculas fluorescentes é realizada para determinar o estado...

Espectroscopia de Flutuação de Fluorescência para Estudar a Homo-Oligomerização de Proteínas

Neste vídeo, descrevemos a técnica de anisotropia de fluorescência para estudar as interações entre a proteína da síndrome de Shwachman-diamante marcada com fluoróforo (SBDS) e a 1 GTPase semelhante ao fator de alongamento (EFL1). Na incubação de proteínas SBDS com concentrações gradualmente crescentes de EFL1, observa-se um aumento constante na anisotropia, indicando uma interação bem-sucedida entre as duas proteínas.

Detecção baseada em anisotropia de fluorescência de interações proteína-proteína

Este vídeo descreve a anisotropia de fluorescência de alto desempenho que ajuda a monitorar a interação entre os fatores de transcrição e o DNA. O ensaio monitora as interações de uma molécula de DNA marcada com fluoróforo com seu fator de transcrição específico, medindo o grau de polarização devido à rotação molecular ou anisotropia do DNA marcado com fluoróforo.

Anisotropia de fluorescência para determinar a afinidade de ligação do fator de transcrição-DNA

Aqui, apresentamos um protocolo para obter dados de três cores de smFRET e sua análise com um ensemble 3D Hidden Markov modelo. Com esta abordagem, cientistas podem extrair informações cinéticas de sistemas complexos proteína, incluindo cooperatividade ou interações correlacionadas.

Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

Este protocolo descreve uma abordagem livre de calibração para quantificação da proteína homo-oligomerização em vitro baseado em espectroscopia de fluorescência flutuação utilizando microscopia de luz comercial. As configurações corretas de aquisição e métodos de análise são mostrados.

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Este protocolo descreve uma abordagem de baseados em espectroscopia de flutuação de fluorescência para investigar interações entre proteínas mediando as interações célula-célula, ou seja, as proteínas localizadas em cruzamentos de célula, diretamente em células vivas. Nós fornecemos orientações detalhadas na calibração de instrumentos, aquisição de dados e análise, incluindo correcções de fontes possível artefato.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) entre duas moléculas de fluoróforo pode ser usada para estudar as interações proteicas na célula viva. Aqui, um protocolo é fornecido sobre como medir o FRET em células vivas, detectando a emissão sensibilizada do aceptor e a têmpera da molécula doadora usando microscopia confocal de varredura a laser.

Avaliando interações proteicas em células vivas com emissão sensibilizada por FRET

Apresentamos um protocolo experimental e um fluxo de trabalho de análise de dados para realizar espectroscopia de correlação transversal de fluorescência de células vivas (FCCS) combinada com a transferência de energia de ressonância förster (FRET) para estudar a dinâmica do receptor de membrana em células vivas usando técnicas modernas de rotulagem de fluorescência.

Espectroscopia de fluorescência de dupla cor para estudar interação proteína-proteína e dinâmica de proteína em células vivas

Aqui, apresentamos o protocolo para estudar a flexibilidade local e a dinâmica de biomoléculas usando anisotropia de fluorescência resolvida no tempo no nível de molécula única no modo de microscopia confocal.

Anisotropia de fluorescência resolvida no tempo de moléculas únicas para caracterizar a flexibilidade local em biomoléculas

Aprenda a usar anisotropia de fluorescência para quantificar interações proteína-proteína entre SBDS e EFL1. Esta técnica fornece dados quantitativos e qualitativos essenciais para estudos de bioquímica e biofísica celular.

Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Explorar mais vídeos