Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

interações proteína estão no cerne da função de uma célula. calorimétrica técnicas espectroscópicas e são vulgarmente utilizados para os caracterizar. Aqui, descrevemos a anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar a interacção entre a proteína mutada na Síndrome Shwachman- diamante (SBDS) e o factor de alongamento como uma GTPase (EFL1).

O objetivo geral deste experimento é avaliar e quantificar a interação entre duas proteínas de interesse usando Anisotropia de Fluorescência. Essas medidas podem ajudar a responder a perguntas-chave. O campo da bioquímica de proteínas e biofísica de proteínas, como proteínas cujas interações são importantes para a função celular.

A principal vantagem desta técnica é que podemos obter informações quantitativas e qualitativas sobre a interação proteína-proteína. Para preparar a proteína SBDS-FlAsH purificada, primeiro prepare um litro de meio líquido LB suplementado com 100 microgramas por mililitro de ampicilina. E nele, a cultura transformou bactérias a 37 graus Celsius até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja 0,5 a 0,7.

Induza a expressão da proteína SBDS-FlAsH adicionando IPTG 0,5 milimolar à cultura e continue a incubação por mais cinco horas. Em seguida, coletar a suspensão bacteriana por centrifugação a 3800 vezes G por dez minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante.

Ressuspenda as células em 35 mililitros de manteiga de lise SBDS suplementada com um PMSF milimolar. Lise por sonicação por um tempo total de quatro minutos usando ciclos de dez segundos ligado e 30 segundos desligado a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue a amostra a 9.000 vezes G por 50 minutos a quatro graus Celsius.

Mantenha o sobrenadante e descarte a paleta para remover detritos celulares. Depois de equilibrar a coluna de afinidade de níquel com três volumes de coluna de tampão de lise SBDS, introduza todo o sobrenadante clarificado na coluna. Remova a proteína não ligada lavando com três volumes de coluna de tampão de lise SBDS.

Após a lavagem da coluna, eluir a proteína ligada com três volumes de coluna de tampão de eluição SBDS. Para purificar ainda mais a proteína, equilibre a coluna do trocador de cátions sulfopropílico com três volumes de coluna de tampão de coluna S com baixo teor de sal. Diluir a proteína seis vezes com tampão fosfato 50 milimolar PH 6,5 e introduzi-la na coluna.

Lave o material não ligado com três volumes de coluna de tampão de coluna S com baixo teor de sal. Em seguida, elui a proteína em uma etapa adicionando 50 tampão fosfato milimolar PH 6,5, um cloreto de sódio molar na coluna. Diluir o eluído três vezes com tampão fosfato 50 milimolar PH 6,5.

Em seguida, concentrar a proteína com dispositivos de ultrafiltração por centrifugação a 3800 vezes G durante quinze minutos. A qualidade das proteínas utilizadas neste tipo de experimento é muito potente. A interpretação dos dados fica complicada se as amostras de proteína usadas não forem de alta pureza.

Verifique a pureza da proteína SBDS-FlAsH por análise SDS-PAGE e coloração de Coomassie. Congele rapidamente a proteína em nitrogênio líquido e armazene-a a 80 graus Celsius negativos até o uso posterior. Para preparar a proteína EFL1 purificada, a primeira cultura transformou a levedura a 30 graus Celsius em um litro de meio sintético sem uracila, suplementado com 0,5% de glicose até que a densidade óptica de 600 nanômetros atinja 1,8.

Induza a expressão de proteínas adicionando 2,8% de galactose à cultura e continue a incubação por 18 horas a 30 graus Celsius. Coletar a suspensão de levedura por centrifugação a 3800 vezes G por dez minutos a quatro graus Celsius. Remover o sobrenadante após centrifugação.

Ressuspenda as células em 50 mililitros de tampão de lise EFL1 suplementado com um PMSF milimolar e um benzamidina. Interrompa as células por fricção em um batedor de contas usando contas de vidro por um tempo total de seis minutos usando ciclos de dois minutos ligados e quinze minutos desligados a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue a amostra a 9.000 vezes G por 50 minutos a quatro graus Celsius.

Mantenha o sobrenadante e descarte o palato para remover os detritos celulares. Em seguida, equilibre a coluna de afinidade de níquel com três volumes de coluna de tampão de lise EFL1. Introduzir todo o sobrenadante clarificado na coluna equilibrada.

Depois de remover a proteína não ligada lavando a coluna com três volumes de coluna de tampão de lise EFL1, eluir a proteína ligada com três volumes de coluna de tampão de eluição EFL1. Para purificar ainda mais a proteína EFL1, equilibre a coluna de exclusão de tamanho com 1,5 volumes de coluna de tampão anisotropia. Concentrar a proteína EFL1 iludida da coluna de afinidade de níquel em um mililitro com dispositivos de ultrafiltração por centrifugação a 3800 vezes G. Em seguida, introduzir a amostra concentrada na coluna de exclusão de tamanho.

Coletar a proteína iludida e concentrar por ultrafiltração até uma concentração final de aproximadamente 30 micromolares. Verifique a pureza da proteína EFL1 por análise SDS-PAGE e coloração de Coomassie. Congele rapidamente a proteína em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius negativos até o uso posterior.

Misture três nanomoles da proteína SBDS-FlAsH com três nanomoles do corante verde lumio em um volume de cinco micrômetros de tampão de anisotropia. Deixe a reação prosseguir por oito horas a quatro graus Celsius. Após oito horas, dialise a amostra contra o tampão de anisotropia durante a noite para remover o corante livre.

Meça os absorventes em 280 nanômetros e 508 nanômetros em um espectrofotômetro usando uma cubeta de quartzo. Em seguida, use a Lei de Lambert-Beer para quantificar a porcentagem de proteína rotulada conforme descrito no protocolo de texto. Antes de medir o valor da anisotrofia, cada etapa de filtração da legião de proteínas deve ser feita com cuidado, garantindo que toda a amostra seja dispensada na solução e se torne homogênea.

Em uma cubeta de fluorescência, coloque 200 microlitros de 30 nanomolares SBDS-FlAsH em tampão anisotrofia e titule dois microlitros de 30 micromolares EFL1. Misturar bem e deixar repousar durante três minutos antes de medir o valor de anisotrofia e fluorescência. Repita este processo até que um volume total de 40 microlitros de EFL1 tenha sido adicionado.

Como etapa final, ajuste os dados a um modelo de associação presumido, conforme descrito no protocolo de texto. Para realizar qualquer experimento de anisotrofia, é importante descartar grandes mudanças na intensidade da fluorescência. Como mostrado aqui, a fluorescência de SBDS-FlAsH não muda visivelmente ao se ligar ao EFL1.

A titulação de EFL1 em uma cubeta de quartzo contendo SBDS-FlAsH resulta em um aumento da anisotrofia inicial observada. Várias adições de EFL1 descrevem a curva de ligação correspondente que pode ser ajustada usando regressão de mínimos quadrados não linear para um modelo de ligação presumido. Nesse caso, um modelo de um local de ligação não descreve adequadamente os dados experimentais.

Em vez disso, um modelo de dois locais de ligação não idênticos descreve adequadamente os dados experimentais. Uma vez dominado, o experimento de ligação de anisotrofia de fluorescência pode ser feito em três horas se for realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante ter proteína purificada em grandes quantidades.

Paralelamente a este procedimento, outros métodos como este costumavam ter com ensaio de complementação baseado em fragmentos, ou anisotrofia de fluorescência com diferentes domínios da proteína estudada podem ser realizados a fim de suportar o modelo de ligação apropriado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um experimento de ligação seguido de anisotrofia de fluorescência.