Name: Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a usar anisotropia de fluorescência para quantificar interações proteína-proteína entre SBDS e EFL1. Esta técnica fornece dados quantitativos e qualitativos essenciais para estudos de bioquímica e biofísica celular.

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Os autores agradecem o apoio financeiro dos projetos CONACyT números 167359 e 177138, e do projeto número IN201615 da DGAPA-UNAM.

1. SBDS-flash Expressão Tag e purificação de proteínas NOTA: Para as experiências de anisotropia, uma FLASH-tag que corresponde à sequência Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys foram adicionados ao C-terminal da sequência de codificação SBDS humanos por PCR. Esta construção foi subclonado no vector de expressão pRSET-A e transformada em células C41 de Escherichia coli para expressar uma proteína que codifica uma etiqueta de hexa-histidina N-terminal (His-tag), as SBDS humanos e uma sequência C-terminal 10 Flash tag de codificação. <ol><li> A expressão da proteína SBDS-flash <ol><li> Transformar E. competente coli C41 com o plasmídeo pRSET-HisSBDS-flash usando um protocolo de choque térmico padrão de 19. Placa as células em meios sólidos Luria-Bertani (LB) suplementado com 100 ug / ml de ampicilina. LB composição meio sólido consiste em 10 g de NaCl, 5 g de extracto de levedura, 10 g de triptona e 20 g de agar para o volume de 1 litro. </li><li> Culturas de bactérias transformadas a 37 ° C atéabsorvância a 600 nm (A 600) atinge 0,5-0,7 em 1 L de meio líquido LB suplementado com 100 ug / ml de ampicilina. </li><li> Induzir a expressão da proteína por adição de 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido para a cultura e a incubação continua durante mais 5 h. </li><li> Recolha a suspensão bacteriana por centrifugação a 3800 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante. Neste ponto, quer armazenar o sedimento de células à temperatura de -20 ° C ou utilizar imediatamente para purificação de proteínas. </li></ol></li><li> Purificação de proteínas SBDS-flash NOTA: Todos os passos cromatográficos são realizadas utilizando um sistema de cromatografia líquida (FPLC) de proteína rápida ou uma bomba peristáltica. Cromatografia em Ni 2+ -affinity usa uma coluna de fluxo rápido de 5 ml. cromatografia de troca aniônica usa um 5 ml forte coluna de permutador de sulfopropil cação. Uma taxa de fluxo de 3 ml / min foi usado para todos os passos cromatográficos. <ol><li> Ressuspender as células em 35 ml de lise b SBDSpode ser prejudicado (tampão fosfato 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) suplementado com fluoreto de 1 mM de fenilmetilsulfonilo (PMSF) e lise por sonicação durante um tempo total de 4 minutos com ciclos de 10 segundos ligado e 30 segundos desligado, a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a amostra a 9000 xg durante 50 min a 4 ° C. </li><li> Manter o sobrenadante e descartar o sedimento para remover os restos celulares. </li><li> Equilibrar a coluna de afinidade de Ni 2+ com 3 volumes de coluna (CV) de tampão de lise e SBDS introduzir a totalidade clarificada sobrenadante na coluna. </li><li> Remover a proteína não ligada por meio de lavagem com 3 CV de tampão de lise SBDS e eluir com 3 CV de tampão de eluição SBDS (tampão fosfato 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM). </li><li> Dilui-se a proteína 6 vezes eluída com tampão fosfato 50 mM pH 6,5 e remover possíveis agregados por filtração através de uma membrana de celulose de 0,22 um. </li><li> Equilibrar a coluna sulfopropil cátion trocador com 3 CV de baixo teor de sal coluna Stampão (tampão de fosfato 50 mM pH 6,5, NaCl 50 mM) e introduzir a amostra de proteína a partir do passo anterior. </li><li> Lave o material não ligado com 3 CV de tampão de baixo teor de sal coluna de S e elui-se a proteína num único passo, com tampão de fosfato 50 mM pH 6,5, NaCl 1 M. </li><li> Dilui-se a proteína de 3,3 vezes eluída com tampão fosfato 50 mM de pH 6,5. Concentra-se a proteína com dispositivos de ultraf iltração por centrifugação a 3800 xg durante 15 min. Flash congelar a proteína em azoto líquido e armazená-lo a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Verifique a pureza da proteína por análise de SDS-PAGE e coloração com Coomassie 20. </li></ol></li></ol> 2. EFL1 Protein Expression and Purification NOTA: EFL1 foi expressa sob a regulação da Gal 1/10 promotor divergente 21 e o Saccharomyces cerevisiae MAT A 3&#39;UTR no pRS426 vetor. A proteína recombinante codifica a isoforma humana EFL1 1 fundido com uma protease de vírus do tabaco Etch (TEV) local de reconhecimento e um tag de hexa-histidina na extremidade C-terminal. <ol><li> A expressão da proteína EFL1 <ol><li> Transformar S. células cerevisiae BCY123 com o plasmídeo pRS426-EFL1TevHis utilizando um protocolo de acetato de lítio padrão 22. Placa todas as células transformadas em queda para fora sintético sem uracilo meios (SD-URA) suplementado com 2% (w / v) de glucose. Composição dos meios SD-URA consiste de 8 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, casaminoácidos 11 g, 55 mg de sulfato de adenina, 55 mg de tirosina, leucina 60 mg e 60 mg de triptofano para o volume de 1 litro. </li><li> Cultura de levedura transformadas a 30 ° C até 600 um atinge 1,8 em 1 L de meio SD-URA suplementado com 0,5% (w / v) de glucose. </li><li> Induzir a expressão da proteína por adição de 2,8% de galactose (v / w) para a cultura e a incubação continua durante mais 18 h a 30 ° C. </li><li> Recolha a suspensão de levedura por centrifugação a 3800 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante.Neste ponto, quer armazenar o sedimento de células à temperatura de -20 ° C ou utilizar imediatamente para purificação de proteínas. </li></ol></li><li> Purificação de proteínas EFL1 NOTA: Todos os passos cromatográficos são realizadas utilizando um sistema de FPLC ou de uma bomba peristáltica. Cromatografia em Ni 2+ -affinity usa uma coluna de fluxo rápido de 5 mL a uma taxa de fluxo de 3 mL / min. A cromatografia de exclusão de tamanho usa uma coluna de 125 ml de pré-embalada com resina Superdex 200 com um caudal de 1 ml / min. <ol><li> Ressuspender as células em 50 ml de EFL1 tampão de lise (Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, MgCl 5 2, 10% glicerol) suplementado com PMSF 1 mM e benzamidina 1 mM e à dissociação das células por atrito sobre um batedor de grânulo usando esferas de vidro (o = 0,5 mm) durante um tempo total de 6 min, utilizando ciclos de 2 minutos a 15 minutos e DESLIGADO, a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a amostra a 9000 xg durante 50 min a 4 ° C. </li><li> Manter o sobrenadante e descartar o sedimento para remover os restos celulares. </li&gt; <li> Equilibrar a coluna de afinidade de Ni 2+ com 3 CV de tampão de lise e EFL1 introduzir todo o sobrenadante clarificado numa coluna. </li><li> Remover a proteína não ligada por meio de lavagem com 3 CV de tampão de lise EFL1 e eluir com 3 CV de tampão de eluição EFL1 (50 mM de Tris-HCl a pH 8, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM, MgCl 2 5, 10% de glicerol). </li><li> Equilibrar a coluna de exclusão de tamanho, com 1,5 VC de tampão de anisotropia (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, MgCl 2 5, 10% de glicerol, 5 mM de β-mercaptoetanol). </li><li> Concentra-se a 1 ml da proteína EFL1 eluído a partir da coluna de afinidade de Ni 2+ com dispositivos de ultraf iltração por centrifugação a 3800 xg para o volume desejado. Introduzir a amostra na coluna de exclusão de tamanho. </li><li> Recolha a proteína eluida e concentra-se por ultrafiltração até uma concentração final de cerca de 30 uM. Flash congelar a proteína em azoto líquido e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. Verifique the pureza da proteína por análise de SDS-PAGE e coloração com Coomassie 20. </li></ol></li></ol> 3. Rotulagem de SBDS-flash com o flash corante fluorescente 4 &#39;, 5&#39;-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) Fluoresceína <ol><li> Misturar 3 nmol de proteína SBDS-flash com 3 nmol do 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) corante f luoresceína em volume de 5 ul de tampão de anisotropia. </li><li> Deixe a reacção prosseguir durante 8 horas a 4 ° C. Diálise da amostra contra tampão Anisotropy durante a noite para remover o corante livre. </li><li> Usar a lei de Lambert-Beer para quantificar a% de proteína marcada. Medir a absorvância a 280 nm e 508 nm num espectrofotómetro usando uma cuveta de quartzo de volume apropriado. NOTA: Considere os seguintes coeficientes de absorção molar (M -1 cm -1): <img alt="Equation1B" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1B.jpg" /></li><li> Calcular a concentração de proteína SBDS-flash marcado usando a Equação 2. <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq2.jpg" /></li><li> Calcular a concentração de proteína total SBDS usando a Equação 3, substituindo o calculado C SBDS-flash a partir do passo anterior. <img alt="Equation3" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq3.jpg" /></li><li> Calcular a percentagem de proteína marcada usando a Equação 4. <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq4.jpg" /></li></ol> 4. Experiências de Anisotropia de fluorescência NOTA: Anisotropia experiências foram feitas em um espectros luorómetro equipado com uma caixa de ferramentas de polarização e recolha de dados foi realizada utilizando o programa de anisotropia fornecida no software do equipamento. O comprimento de onda de excitação foi fixado em 494 nm com uma largura de banda espectral de 8 nm e a emissão foi registada utilizando um filtro passa-banda de 530 ± 25 nm. As medições foram realizadas a 25 ° C em 200 ul de uma cuvete com um comprimento do percurso 10 5 milímetros. <ol><li><html> Em uma tina de fluorescência, coloque 200 mL de 30 nm SBDS flashes em tampão anisotropia e titular 2 ul de EFL1 30? M. Misture bem e deixe a reacção repousar durante 3 min antes de medir o valor de anisotropia. </li><li> Repetir o passo 4.1 até um volume total de 40 ul de EFL1 foi adicionado. </li></ol> Análise 5. Os dados <ol><li> Ajustar os dados para o modelo de encadernação adequada usando um algoritmo de regressão por mínimos quadrados não-linear. As equações para os modelos mais comuns de ligação são apresentados na Tabela 1. </li><li> Avaliar o melhor modelo que descreve a interação entre as proteínas inspecionando os resíduos do ajuste 23. Apoiar o modelo escolhido com experimentos adicionais. </li></ol> Tabela 1. Modelos de ligação comum de interação proteína-proteína e as equações matemáticas que os descrevem.0 / 54640table1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela. <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640table1.jpg" />

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Os autores não têm nada a divulgar e não têm interesses financeiros concorrentes.

A maioria das experiências bioquímicas com proteínas requerem não só proteína pura, mas também uma grande quantidade deles, independentemente da técnica utilizada. Por esta razão, as proteínas utilizadas para este tipo de experiências são obtidos por expressão heteróloga, como era o caso aqui apresentado. espectroscopia de fluorescência requer a presença de um fluoróforo na molécula estudada. resíduos aromáticos constituem os fluoróforos intrínsecas de uma proteína, no entanto, utilizando o seu sinal para estudar as int...

As células contêm um grande número de biomacromoléculas constantemente que interagem uns com os outros. Esta associação dá origem a complexos que participam nas vias celulares responsáveis ​​para o seu funcionamento na transdução de sinal, a regulação da expressão do gene e a migração de células, entre outros. Todas as interacções proteína-proteína que ocorrem numa célula compreendem uma rede conhecida como a interactoma. Em Saccharomyces cerevisiae foram mostrados mais do que 70% das suas proteínas de ter parceiros interactuantes 1. Compreender o interactome de uma célula e suas funções fornecem informações relevantes sobre a complexidade e diversidade dos organismos vivos. Várias metodologias têm sido descritos para identificar e caracterizar as interacções proteína-proteína. Diferente alta através de métodos colocados como a levedura de dois híbridos 2, ensaios de complementação de proteína-fragmento de 3, 4 purificação por afinidade acoplada a espectrometria de massa e microarra proteínays são utilizados para identificar uma interacção 5,6. Uma vez identificado, é necessário para a sua validação e pode variar numa base de caso-a-caso. Tipicamente, estas experiências envolvem interromper a interacção si ao nível dos membros individuais do par de interacção, por exemplo, por deleção do gene ou a superexpressão de uma das proteínas, e, em seguida, à procura de mudanças nas propriedades ou a função do outro membro do nível celular. Subsequentemente, as técnicas biofísicas 7 são usados para caracterizar a interacção proteína-proteína, a nível molecular. Para este fim, a estrutura dos complexos de proteína são determinadas por cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear e microscopia crio-electrões enquanto calorimetria e espectroscopia de fluorescência são usadas para quantitativamente e mecanisticamente os descrever. Neste trabalho, Anisotropia de fluorescência foi usada como uma técnica para caracterizar a interacção entre a GTPase EFL1 e SBDproteína S. Estas proteínas participam na síntese de ribossomas, promovendo a libertação do factor de iniciação eucariótico 6 a partir da superfície das subunidade ribossomal 60S 8. A proteína SBDS está mutado em uma doença conhecida como síndrome de Shwachman- diamante 9 e actua como um factor de troca do nucleótido guanina para EFL1 diminuindo a sua afinidade para o difosfato de guanosina 10,11. mutações doença em SBDS abolir a interação com EFL1 e, assim, evitar a sua activação. Anisotropia de fluorescência é comumente utilizado em aplicações biológicas para estudar proteína-péptido ou interacções proteína-ácido nucleico. Baseia-se no princípio de que um fluoróforo excitado com resultados de luz polarizada em uma emissão parcialmente polarizado. anisotropia de fluorescência é definido pela Equação 1: <img alt="equação1" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1.jpg" /> onde VV e VH são osintensidades de fluorescência da vertical (VV) e horizontal (VH) polarizado emissão quando a amostra está animado com verticalmente luz polarizada 12. Anisotropia de fluorescência é sensível a factores que afectam a taxa de difusão de rotação do fluororo e, portanto, depende da temperatura, da viscosidade da solução e o tamanho molecular aparente do fluoróforo. O tamanho aparente de uma proteína que contém um fluoróforo aumenta quando ele interage com uma outra proteína e em seguida, tal mudança pode ser avaliada como uma alteração na anisotropia. Mais especificamente, um fluoróforo, que roda lentamente em solução em relação ao seu tempo de vida de fluorescência terá um grande valor I VV e o valor pequeno I VH e, por conseguinte, irá apresentar uma relativamente grande anisotropia. Para fluoróforos que caem rapidamente em relação ao seu tempo de vida de fluorescência, eu VV e VH I será semelhante eo seu valor de anisotropia será pequeno 12 </sup&gt; (Figura 1). Além disso, para um bom sinal de anisotropia para medição de ruído, é necessário ter um fluoróforo com um tempo de vida de fluorescência similar ao tempo de correlação rotacional da molécula de interesse. Caso contrário, não é possível registar com precisão a diferença de anisotropia entre a proteína livre e que, no complexo. Por exemplo, a anisotropia de uma sonda fluorescente, com um tempo de vida perto de 4 ns, tais como fluoresceína ou rodamina ligados a um composto de baixo peso molecular de 100 Da é 0,05. A ligação a uma molécula de 160 kDa vai aumentar o seu valor de anisotropia de 0,29; uma diferença que pode ser medido com precisão. Em contraste, a mesma sonda fluorescente envolvido numa reacção de ligação cuja aumento no tamanho molecular varia de 65 a 1000 kDa só vai resultar numa alteração de anisotropia de 0,28 a 0,3, o que é demasiado pequeno para ser medido com precisão. Neste cenário, uma sonda com uma vida útil de 400 nanossegundos seria mais adequado 12. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640fig1.jpg" /> Figura 1. Representação esquemática do equipamento utilizado para medir a anisotropia de fluorescência e o procedimento. Representação esquemática do equipamento utilizado para realizar uma medição de fluorescência anisotropia experimento interacção proteína-proteína. Fluoróforos que caem rápido pequena anisotropia de exibição que aumenta após ligação a um parceiro de interação. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> aplicações de fluorescência requerem a presença de um fluoróforo em qualquer uma das moléculas estudadas. Para estudar as interacções proteína-proteína, existem três tipos de fluoróforos: 1) os resíduos de triptofano presentes nas proteínas, 2) fluoróforos ligados quimicamente e 3) parceiros de fusão fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde (GFP) e a sua derivativas. A maioria das proteínas têm resíduos de triptofano na sua estrutura, portanto, a forma mais fácil de medir uma interacção é através da monitorização das alterações na espectros de fluorescência correspondente ou por monitorização das alterações na intensidade de fluorescência dos resíduos de triptofano. No entanto, os resíduos de triptofano podem estar presentes em ambas as proteínas que complicam a análise. Por outro lado, para um fluoróforo para alterar as suas propriedades fluorescentes, devido a uma interacção precisa de ser localizado em ou perto do local de ligação e que poderia interferir com a própria interacção. Este precisa de atenção especial quando se utiliza fluoróforos volumosos, como GFP. Se nenhum destes fluoróforos podem ser utilizados para estudos de ligação é necessário, em seguida, introduzir fluoróforos extrínsecos ao uma das proteínas envolvidas. Existem muitos fluoróforos quimicamente sintetizados e podem ser ligados covalentemente a proteínas através dos seus grupos reactivos tais como os grupos amina da cadeia lateral (de lisinas ou no terminal N) e os grupos tiol na cisteína. Fderivados luorophore com ésteres de succinimidilo e isotiocianato de reagir com grupos de amida, enquanto a iodoacetamida e maleimida são grupos 13-tiol reactivos. Os corantes mais comuns usados ​​em aplicações de fluorescência são derivados da fluoresceína e rodamina os corantes verdes, cumarinas, e corantes BODIPY fluoróforos Alexa Fluor. Uma lista detalhada de fluoróforos disponíveis comercialmente e a sua utilização pode ser encontrada em referências 14,15. Para a marcação com êxito, o grupo reactivo deve ser expostos na superfície da proteína, mas, devido ao grande número de grupos funcionais reactivos, tipicamente presentes em polipéptidos, é muito difícil conseguir a modificação específica do local. A proteína de interesse neste estudo, SBDS, contém 5 cisteínas livres e 33 lisinas que podem resultar na marcação de vários sites. rotulagem não uniforme pode afectar a ligação e vai complicar a análise de dados como moléculas fluoróforo diferentes podem provocar diferentes sinais de intensidade de fluorescência após a ligação. para overcome esse problema, foi utilizado o fluoróforo flash, 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína com o selo de site direto da proteína SBDS. Este é um corante arsenoxide com uma elevada afinidade para quatro cisteínas espaçadas num motivo conhecido como FLASH-tag que consiste na sequência de CCXXCC onde X é qualquer aminoácido excepto cisteína 16,17. Este motivo tetracisteï¿½a é adicionado à extremidade N ou C-terminal da proteína através da engenharia genética juntamente com um ligante apropriado para evitar o rompimento da dobragem global da proteína. O par constituído por corante flash e-tag foi originalmente concebido para proteínas de etiquetas específicas do local em células 17 que vivem, mas também pode ser usado para rotular proteínas purificadas in vitro, como é exemplificado aqui. Além disso, as estratégias enzimáticas também têm sido desenvolvidos para permitir a funcionalização do local específico de proteínas 18. Nesse artigo, procuramos descrever a utilidade da fluorescência anisotropia umferramenta sa para estudar as interações proteína-proteína. A ligação pode ser avaliada através de uma simples inspecção da forma da curva de ligação enquanto que a informação quantitativa pode ser obtida a partir do ajuste dos dados experimentais.

<table><tbody><tr><td>Contas de vidro de 0,5 mm</td><td>Produtos Biospec</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Para Médio</td><td>TRIS01</td><td>Corante ultra puro</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolano-2-il) fluoresceína</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>LC6090</td><td>Este kit contém o corante para rotular uma etiqueta FlAsH</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB02040</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glicose Anidra</td><td>Para Meio</td><td>GLU03</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Galactose</td><td>Para Meio</td><td>GAL03</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Para</td><td>Meio DOC0157</td><td></td></tr><tr><td>L-Triptofano&nbsp;</td><td>Para hidrocloro</td><td>de</td> bezamidina DOC0189 <td></td>médio</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-5G</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Gold Biotechnology, Inc</td><td>P-470-25</td><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonil</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Para cloreto</td> de sódio <td>NAC02</td><td>para médio&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Tecsiquim, S.A. de C.V.</td><td>GT1980-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>1725711000</td><td>Cloreto de Magnésio</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Fosfato de potássio dibásico</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139-500G</td><td>Fosfato de sódio monobásico</td></tr><tr><td>Base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Formedium</td><td>YEM03</td><td>Micro Granulated</td></tr><tr><td>L-Tyroisne</td><td>Formedium</td><td>DOC0193</td><td></td></tr><tr><td>sulfato</td> <td>de adeninaPara médio</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos Casamino</td><td>Para médio</td><td>CAS03</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB49182</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Para médio</td><td>IPTG025</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtração</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>UFC901096</td><td>Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10&nbsp; Filtro de Membrana kDa</td></tr><tr><td></td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>GSWP04700</td><td>Filtro de Membrana, ésteres de celulose mistos, Hidrofílico, 0.22&nbsp; &micro; m, 47&nbsp; mm, branco, liso</td></tr><tr><td>Ni2+ coluna de afinidade</td><td>QIAGEN</td><td>30760</td><td>Cartucho pré-preenchido com 5&nbsp; ml Coluna de</td></tr><tr><td>trocador de cátions de sulfopropil forte</td> Ni-NTA <td>Superflow GE Healthcare Life Science</td><td>17-5157-01</td><td>HiTrap SP Sepharose FF 5 ml</td></tr><tr><td>Coluna de exclusão de tamanho</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>Célula de fluorescência</td><td>Hellma Analytics</td><td>111-057-40</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6860AA</td><td>Agitador UV-Vis Cary 60</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>SHKA4000-7</td><td>MaxQ 4000 Faixa de temperatura de bancada Ambiente-15&deg; a 60&deg; </td></tr><tr><td>C Centrífuga</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004271</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td></tr><tr><td>FPLC</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>Sistema FPLC descontinuado</td><td>condutividade Monitor UV-MM II P500 fração da bomba</td></tr><tr><td>Espectrofluorômetro</td><td>Olis</td><td>Não aplicável</td><td>Olis DM 45 com caixa de ferramentas de polarização</td></tr></tbody></table>

anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

interacções proteína-proteína desempenham um papel fundamental na função de um organismo vivo. Uma vez que uma interacção tem sido identificadas e validadas, é necessário caracterizar-la ao nível estrutural e mecânica. Existem vários métodos bioquímicas e biofísicas para tal finalidade. Entre eles, Anisotropia de fluorescência é uma técnica poderosa particularmente utilizado quando a intensidade de fluorescência de uma proteína marcada com fluoróforo permanece constante após a interacção proteína-proteína. Nesta técnica, uma proteína marcado com fluoróforo é animado com luz polarizada verticalmente de um comprimento de onda apropriado que excita selectivamente um subconjunto dos fluoróforos de acordo com a sua orientação em relação com o feixe de entrada. A emissão resultante também tem uma direcionalidade cujo relacionamento nos planos vertical e horizontal define anisotropia (r) como segue: r = (I VV -I VH) / (I VV + 2I VH), onde eu VV e eu <sUB&gt; VH são as intensidades de fluorescência das componentes verticais e horizontais, respectivamente. Anisotropia de fluorescência é sensível à difusão de rotação de um fluoróforo, ou seja, o tamanho molecular aparente de um fluoróforo ligado a uma proteína, que é alterado por interacção proteína-proteína. No presente texto, a utilização da anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interacções proteína-proteína foi exemplificado para tratar a ligação entre a proteína mutada na Síndrome Shwachman- diamante (SBDS) e o factor de alongamento como-1 GTPase (EFL1). Convencionalmente, a etiquetagem de uma proteína com um fluoróforo é realizada sobre os grupos tiol (cistea) ou nos grupos amino (a amina N-terminal ou da lisina) da proteína. No entanto, SBDS possui várias cisteínas e lisinas que não permitiam site de rotulagem dirigido dele. Como uma técnica alternativa, o corante de 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína foi utilizado para marcar especificamente um motivo tetracisteï¿½a, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, geneticamente modificada no terminal C da proteína recombinante SBDS. Montagem dos dados experimentais fornecida informação quantitativa e mecanística sobre o modo de ligação entre estas proteínas.

Para realizar qualquer experiência anisotropia é importante para descartar grandes mudanças na intensidade de fluorescência do fluoróforo uma vez que a anisotropia observada de uma mistura de espécies é representado pela Equação 5: <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq5.jpg" /> onde F i representa a fluorescência fraccionada de ...

interações proteína estão no cerne da função de uma célula. calorimétrica técnicas espectroscópicas e são vulgarmente utilizados para os caracterizar. Aqui, descrevemos a anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar a interacção entre a proteína mutada na Síndrome Shwachman- diamante (SBDS) e o factor de alongamento como uma GTPase (EFL1).

Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

O objetivo geral deste experimento é avaliar e quantificar a interação entre duas proteínas de interesse utilizando Anisotropia de Fluorescência. Essas medidas podem ajudar a responder perguntas fundamentais na área de bioquímica e biofísica de proteínas, como quais interações proteicas são importantes para a função celular.A principal vantagem desta técnica é que podemos obter informações quantitativas e qualitativas sobre a interação proteína-proteína. Para preparar a proteína SBDS-FlAsH purificada, prepare primeiro um litro de meio líquido LB suplementado com 100 microgramas por mililitro de ampicilina. E nele, cultive bactérias transformadas a 37 graus Celsius até que a densidade óptica em 600 nanômetros atinja de 0,5 a 0,7.Induza a expressão da proteína SBDS-FlAsH adicionando 0,5 milimolar de IPTG ao cultivo e continue a incubação por mais cinco horas. Em seguida, colete a suspensão bacteriana por centrifugação a 3800 × g durante dez minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante.Re-suspenda as células em 35 mililitros de tampão de lise SBDS suplementado com um milimolar de PMSF. Lise por sonicação por um tempo total de quatro minutos, utilizando ciclos de dez segundos

fluorescence-anisotropy-as-tool-to-study-protein-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

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Espectroscopia de Flutuação de Fluorescência para Estudar a Interação de Proteínas em Contatos Celulares

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Espectroscopia de Flutuação de Fluorescência para Estudar a Homo-Oligomerização de Proteínas

Neste vídeo, descrevemos a técnica de anisotropia de fluorescência para estudar as interações entre a proteína da síndrome de Shwachman-diamante marcada com fluoróforo (SBDS) e a 1 GTPase semelhante ao fator de alongamento (EFL1). Na incubação de proteínas SBDS com concentrações gradualmente crescentes de EFL1, observa-se um aumento constante na anisotropia, indicando uma interação bem-sucedida entre as duas proteínas.

Detecção baseada em anisotropia de fluorescência de interações proteína-proteína

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Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Este protocolo descreve uma abordagem de baseados em espectroscopia de flutuação de fluorescência para investigar interações entre proteínas mediando as interações célula-célula, ou seja, as proteínas localizadas em cruzamentos de célula, diretamente em células vivas. Nós fornecemos orientações detalhadas na calibração de instrumentos, aquisição de dados e análise, incluindo correcções de fontes possível artefato.

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Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

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