Detecção baseada em anisotropia de fluorescência de interações proteína-proteína

Para detecção de interação proteína-proteína baseada em anisotropia de fluorescência, comece com proteínas-alvo recombinantes marcadas com motivos de tetracisteína C-terminal em um tampão de anisotropia adequado.

Adicione um corante contendo fluoróforo - ligando-se às proteínas-alvo por meio do motivo de tetracisteína. Dialise com o tampão de anisotropia, removendo o corante não ligado. Transfira a mistura para cubetas de quartzo. Meça a absorbância, determinando a porcentagem de proteínas-alvo marcadas com sucesso.

Em uma cubeta de fluorescência, misture as proteínas-alvo marcadas com fluoróforo com proteínas não marcadas. Usando um espectrofluorômetro, meça a anisotropia de fluorescência.

À medida que as proteínas-alvo são suspensas livremente no tampão, os fluoróforos ligados a elas giram aleatoriamente em torno de seus eixos devido ao movimento browniano. Após a excitação com luz polarizada verticalmente de comprimento de onda apropriado, os fluoróforos emitem luz polarizada nos planos vertical e horizontal. A razão das intensidades de fluorescência das emissões polarizadas vertical e horizontalmente - anisotropia - é medida.

Quando proteínas não marcadas se ligam aos alvos mar