Por que a anisotropia aumenta com a ligação da proteína?

A anisotropia aumenta quando proteínas não marcadas se ligam a alvos marcados com fluoróforo, aumentando o tamanho molecular do complexo e reduzindo o movimento rotacional. Isso resulta em mais luz emitida verticalmente polarizada em relação à luz horizontalmente polarizada. A alteração é medida como um valor mais alto de anisotropia, indicando interação bem-sucedida.

Como é determinada a porcentagem de proteína marcada?

A porcentagem de proteína marcada é quantificada pela medição da absorbância em 280 nm e 508 nm utilizando um espectrofotômetro e uma cubeta de quartzo, seguida pela aplicação da lei de Lambert-Beer. Este passo garante a normalização precisa dos dados de anisotropia em relação à fração de proteínas-alvo marcadas com sucesso. É realizado após a diálise para remover o corante não ligado, eliminando interferências causadas pelo fluoróforo livre.

O que indica um aumento não linear na anisotropia?

Um aumento não linear da anisotropia com a elevação da concentração de proteína não marcada sugere ligação em múltiplos sítios não idênticos no alvo marcado com fluoróforo. Este padrão reflete afinidades de ligação heterogêneas ou interações cooperativas, ao invés de um modelo de sítio único. Dados como esses apoiam uma análise mecanicista mais profunda da complexidade da interação.

Por que a replicação é importante nas titulações de anisotropia?

A replicação garante que cada etapa da titulação seja homogênea e que toda a amostra seja misturada uniformemente antes da medição. Uma mistura inconsistente pode introduzir variabilidade nas leituras de anisotropia, dificultando a interpretação da curva de ligação. A replicação cuidadosa favorece o ajuste confiável dos dados aos modelos de ligação e a comparabilidade entre experimentos.

Qual é o passo analítico que segue a coleta de dados de anisotropia?

Após coletar os valores de anisotropia ao longo de uma série de titulação, os dados são ajustados a um modelo de ligação presumido, conforme descrito no protocolo. Esta etapa permite a quantificação da afinidade de ligação, estequiometria e potencial cooperatividade. O ajuste do modelo transforma as medidas brutas de anisotropia em informações acionáveis para validação de alvo e otimização de compostos iniciais.

Detecção baseada em anisotropia de fluorescência de interações proteína-proteína

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas Biológicas

0 vistas • 3:41 min • July 8th, 2025

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Para detecção de interação proteína-proteína baseada em anisotropia de fluorescência, comece com proteínas-alvo recombinantes marcadas com motivos de tetracisteína C-terminal em um tampão de anisotropia adequado.

Adicione um corante contendo fluoróforo - ligando-se às proteínas-alvo por meio do motivo de tetracisteína. Dialise com o tampão de anisotropia, removendo o corante não ligado. Transfira a mistura para cubetas de quartzo. Meça a absorbância, determinando a porcentagem de proteínas-alvo marcadas com sucesso.

Em uma cubeta de fluorescência, misture as proteínas-alvo marcadas com fluoróforo com proteínas não marcadas. Usando um espectrofluorômetro, meça a anisotropia de fluorescência.

À medida que as proteínas-alvo são suspensas livremente no tampão, os fluoróforos ligados a elas giram aleatoriamente em torno de seus eixos devido ao movimento browniano. Após a excitação com luz polarizada verticalmente de comprimento de onda apropriado, os fluoróforos emitem luz polarizada nos planos vertical e horizontal. A razão das intensidades de fluorescência das emissões polarizadas vertical e horizontalmente - anisotropia - é medida.

Quando proteínas não marcadas se ligam aos alvos marcados com fluoróforo, o tamanho molecular do complexo proteico aumenta, reduzindo seu movimento rotacional. Como resultado, a luz emitida torna-se mais polarizada, com maior emissão no plano vertical do que no plano horizontal - aumentando a anisotropia.

Adicione concentrações crescentes da proteína não marcada e repita a medição da anisotropia.

Um aumento não linear na anisotropia com aumento da adição de proteínas não marcadas indica ligação de proteínas não marcadas em vários locais de ligação não idênticos nas proteínas-alvo marcadas com fluoróforo.

Misture 3 nanomoles da proteína SBDS-FlAsH com 3 nanomoles do corante Lumio Green em um volume de 5 microlitros de tampão de anisotropia. Deixe a reação prosseguir por 8 horas a 4 graus Celsius. Após 8 horas, dialise a amostra contra o tampão de anisotropia durante a noite para remover o corante livre. Meça a absorbância em 280 nanômetros e 508 nanômetros em um espectrofotômetro usando uma cubeta de quartzo. Em seguida, use a lei de Lambert-Beer para quantificar a porcentagem de proteína rotulada, conforme descrito no protocolo de texto.

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Última atualização: 15 agosto 2026

Detecção baseada em anisotropia de fluorescência de interações proteína-proteína

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