Detecção baseada em anisotropia de fluorescência de interações proteína-proteína

Para detecção de interação proteína-proteína baseada em anisotropia de fluorescência, comece com proteínas-alvo recombinantes marcadas com motivos de tetracisteína C-terminal em um tampão de anisotropia adequado.

Adicione um corante contendo fluoróforo - ligando-se às proteínas-alvo por meio do motivo de tetracisteína. Dialise com o tampão de anisotropia, removendo o corante não ligado. Transfira a mistura para cubetas de quartzo. Meça a absorbância, determinando a porcentagem de proteínas-alvo marcadas com sucesso.

Em uma cubeta de fluorescência, misture as proteínas-alvo marcadas com fluoróforo com proteínas não marcadas. Usando um espectrofluorômetro, meça a anisotropia de fluorescência.

À medida que as proteínas-alvo são suspensas livremente no tampão, os fluoróforos ligados a elas giram aleatoriamente em torno de seus eixos devido ao movimento browniano. Após a excitação com luz polarizada verticalmente de comprimento de onda apropriado, os fluoróforos emitem luz polarizada nos planos vertical e horizontal. A razão das intensidades de fluorescência das emissões polarizadas vertical e horizontalmente - anisotropia - é medida.

Quando proteínas não marcadas se ligam aos alvos marcados com fluoróforo, o tamanho molecular do complexo proteico aumenta, reduzindo seu movimento rotacional. Como resultado, a luz emitida torna-se mais polarizada, com maior emissão no plano vertical do que no plano horizontal - aumentando a anisotropia.

Adicione concentrações crescentes da proteína não marcada e repita a medição da anisotropia.

Um aumento não linear na anisotropia com aumento da adição de proteínas não marcadas indica ligação de proteínas não marcadas em vários locais de ligação não idênticos nas proteínas-alvo marcadas com fluoróforo.

Misture 3 nanomoles da proteína SBDS-FlAsH com 3 nanomoles do corante Lumio Green em um volume de 5 microlitros de tampão de anisotropia. Deixe a reação prosseguir por 8 horas a 4 graus Celsius. Após 8 horas, dialise a amostra contra o tampão de anisotropia durante a noite para remover o corante livre. Meça a absorbância em 280 nanômetros e 508 nanômetros em um espectrofotômetro usando uma cubeta de quartzo. Em seguida, use a lei de Lambert-Beer para quantificar a porcentagem de proteína rotulada, conforme descrito no protocolo de texto.

Antes de medir o valor de anisotropia, cada etapa de titulação do ligante de proteína deve ser feita com cuidado, garantindo que toda a amostra seja dispensada na solução e se torne homogênea.

Em uma cubeta de fluorescência, coloque 200 microlitros de 30 nanomolares SBDS-FlAsH em tampão de anisotropia e titule 2 microlitros de 30 micromolares EFL1. Misture bem e deixe a reação repousar por 3 minutos antes de medir o valor de anisotropia e fluorescência. Repita este processo até que um volume total de 40 microlitros de EFL1 tenha sido adicionado. Como etapa final, ajuste os dados a um modelo de associação presumido, conforme descrito no protocolo de texto.