Microscopia de fluorescência intravital para estudar a formação de trombos microvasculares

A microscopia de fluorescência intravital é útil para estudar a indução fototóxica da formação de um trombo - um coágulo sanguíneo - em um local de lesão microvascular.

Comece tomando um camundongo sem pêlos anestesiado injetado com um polissacarídeo marcado com fluoróforo fototóxico. Coloque o mouse em decúbito ventral em uma plataforma de aquecimento para manter a temperatura fisiológica para uma circulação sanguínea adequada.

Coloque a parte apical da orelha sob um microscópio de fluorescência intravital. Após a excitação com a luz, o fluoróforo emite fluorescência - permitindo o monitoramento do fluxo sanguíneo microvascular. Aumente a intensidade da luz para induzir a formação de trombos.

O fluoróforo absorve a luz de alta intensidade e reage com o oxigênio molecular para gerar espécies reativas de oxigênio. Essas moléculas causam estresse oxidativo nas células endoteliais, levando a danos celulares e à exposição da matriz subendotelial.

As células danificadas liberam mediadores trombóticos que unem o colágeno exposto na matriz subendotelial e as plaquetas circulantes, que se ligam aos mediadores por meio de receptores específicos.

A ligação ativa as plaquetas, causando a liberação de moléculas efetoras que ativam e recrutam outras plaquetas circulantes para o local da lesão. As proteínas circulantes do fibrinogênio se ligam aos receptores de fibrinogênio nas plaquetas ativadas - ligando-os para formar um tampão plaquetário.

Visualize o fluxo sanguíneo restrito para confirmar o tampão plaquetário - a etapa primária da formação do trombo.

Coloque o animal na plataforma sob o estereomicroscópio. Use ampliação de 10X. Para a microscopia da orelha direita, prepare a veia jugular esquerda criando primeiro uma incisão de 5 milímetros na pele do pescoço na direção craniocaudal. Em seguida, use microfórceps e microtesouras para dissecar o tecido subcutâneo. Em seguida, libere a veia de sua adventícia sem tocar no vaso.

Agora, use a seringa de insulina previamente preparada para a injeção do corante fluorescente. Segure cuidadosamente a parede do vaso com a micropinça sem perfurar a veia. Penetre na parede do vaso distendido com a agulha da seringa e injete FITC-dextrano por via intravenosa. Retire a agulha e pare o sangramento usando cotonetes. Evite a contaminação do sangue e da tinta do ouvido.

Transfira o animal na placa de aquecimento para uma construção de vidro acral com uma ranhura para a placa de aquecimento e um plano de 0,5 centímetros de altura para posicionar a orelha. Fixe o animal em decúbito ventral na placa de aquecimento usando bandagem adesiva. Coloque a cartilagem convexa na base da orelha ao lado do plano da orelha para que a parte apical da orelha possa ser posicionada plana no plano. Adicione uma gota de aqua à temperatura ambiente à placa de vidro acral. Usando cotonetes, absorva a gota de água e deixe as forças capilares prenderem o plano da orelha ao vidro acral.

A aurícula deve ser posicionada o mais plana possível, mesmo que a cartilagem dê à aurícula uma forma convexa. Portanto, apenas a parte distal mais flexível da aurícula deve ser posicionada na placa de vidro acral. Para evitar danos aos tecidos e extravasamento do corante congelado, toque a orelha o mínimo possível com a pinça.

Em seguida, adicione uma gota de aqua no lado dorsal convexo da orelha. Coloque cuidadosamente uma lamínula na orelha sem comprimir os vasos basais que entram na orelha. Use cotonetes para remover o máximo de água possível sob a lamínula, para minimizar a distância entre a lamínula e os vasos alvo da orelha.

Comece ajustando o microscópio de fluorescência intravital para visualização FITC-dextrana. Transferir o animal preparado para a mesa do microscópio de fluorescência intravital. Usando ampliação de 5X, 10X e 20X e 20% de intensidade de luz, procure um vaso venoso de 50 a 60 mícrons de diâmetro e com fluxo sanguíneo anterógrado.

Adicione uma gota de água à temperatura ambiente à lamínula para imersão em água da objetiva de ampliação de 63X. Imediatamente após a aplicação da gota d'água, iniciar o registro do vaso por 20 segundos para a avaliação inicial do diâmetro e do fluxo sanguíneo. Inicie a indução do trombo 5 minutos após a injeção de FITC-dextrano. Para isso, aumente a intensidade da luz para 100%.

Durante a indução de trombos fototóxicos, feche a abertura do microscópio por 2 segundos em um período de 30 segundos para verificar a oclusão do fluxo sanguíneo. Se o fluxo sanguíneo persistir, abra a abertura novamente. O vaso é classificado como ocluído se o fluxo permanecer parado por 30 segundos ou mais, ou se o fluxo sanguíneo estiver retrógrado. Selecione e oclua cinco vasos por orelha dentro de um período de 1 hora após a injeção de FITC-dextrano.