Isolamento de células T baseado em flotação usando classificação de células ativada por flutuabilidade

Para isolar as células T - glóbulos brancos essenciais para o sistema imunológico - usando a classificação de células ativadas por flutuabilidade, BACS, tome uma suspensão de células mononucleares do sangue periférico, PBMCs. Os PBMCs contêm células T alvo e células não-alvo, como células B, monócitos, células assassinas naturais e células dendríticas.

Adicione um tampão contendo uma quantidade adequada de anticorpo anti-CD3 biotinilado e incube durante o tempo necessário. O anticorpo se liga ao complexo CD3 - um complexo de proteínas multiméricas na superfície celular - uma característica definidora das células T.

Adicione microbolhas funcionalizadas - pequenas partículas esféricas revestidas com estreptavidina - para seleção positiva de células T ligadas a anticorpos. O núcleo de cada microbolha é uma esfera oca, tornando-as partículas de baixa densidade capazes de flutuar em uma solução aquosa.

Incube a mistura sob agitação, permitindo que as microbolhas e a amostra se misturem completamente. Durante a incubação, a estreptavidina na microbolha liga-se à biotina no anticorpo ligado às células T, imobilizando as células nas microbolhas.

Centrifugue o tubo. As células não-alvo separam-se da mistura como um pellet na parte inferior.

As microbolhas ligadas às células T alvo permanecem flutuando na superfície, levando à separação das células T com base na flutuabilidade. Esta técnica de separação limita o estresse nas células-alvo. Com uma pipeta fina, remova o pellet e o sobrenadante sem perturbar a camada de microbolhas.

Ressuspenda as células T isoladas e ligadas a microbolhas em um meio de cultura apropriado para processamento posterior.

Para começar, incubar 3 x 10⁸ PBMCs obtidos comercialmente em 2,5 mililitros de tampão de separação com anticorpo anti-CD3 biotinilado. Misture delicadamente os componentes pipetando e incube-os em temperatura ambiente por 10 minutos.

Adicione microbolhas de estreptavidina às células na proporção de 0,5 para 1, de acordo com as instruções do fabricante, e misture usando um rotador comercial de ponta a ponta a 20 RPM por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. Centrifugue a 400 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.

Após a centrifugação, as células selecionadas positivamente estarão no topo da suspensão com as microbolhas de estreptavidina, e as células não selecionadas restantes estarão no pellet celular no fundo do tubo.

Usando uma pipeta de vidro de 9 polegadas, insira a ponta abaixo da camada de célula da bolha no fundo do tubo. Aspirar o sedimento celular e o sobrenadante com uma pipeta electrónica e transferi-los para um novo tubo.

Ressuspenda a camada de células de bolha deixada no tubo original em 1 mililitro de meio de células T completo. Centrifugue o sobrenadante a 400 x g por 5 minutos à temperatura ambiente e use-o para medição indireta de pureza e recuperação.