Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocit�des do rato de Medula Óssea
4 de novembro de 2016
Relata-se um protocolo de utilização de células activada por fluorescência para isolar células dendríticas plasmocitoides (PDC) com elevado grau de pureza a partir da medula óssea de ratinhos lúpus-propenso para estudos funcionais de PDC.
O objetivo geral deste experimento é isolar células dendríticas plasmocitoides, ou PDC, com alta pureza da medula óssea de camundongos predispostos ao lúpus, para o estudo de sua função. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave relacionadas às características de uma população específica de células imunológ游戏副本ulares, como, por exemplo, as PDC produtoras de interferon alfa durante o estágio tardio do desenvolvimento do lúpus. A principal vantagem desta técnica é que uma ou várias populações-alvo podem ser enriquecidas com maior pureza do que por meio da separação com microesferas magnéticas.
Após a coleta, transfira os ossos dos membros posteriores e quatro mililitros de meio completo para um almofariz. Adicione seis mililitros de meio completo fresco para completar um volume total de 10 mililitros. E quebre suavemente os ossos com um pistilo.
Agite suavemente o pistilo para liberar a medula óssea. Em seguida, transfira todo o meio através de um filtro de 70 micrômetros para um tubo cônico de 50 mililitros sobre gelo. Adicione 10 mililitros de meio completo fresco ao almofariz.
E filtre o sobrenadante mais duas vezes até que os ossos pareçam brancos. Em seguida, centrifugue as células da medula óssea e re-suspenda o pellet em 10 mililitros de meio completo fresco. Depois, sobreponha as células cuidadosamente sobre cinco mililitros de meio de gradiente de densidade recém-preparado em um tubo cônico de 15 mililitros, tomando cuidado para não perturbar as camadas.
E separe as células por centrifugação. Em seguida, remova cuidadosamente os oito mililitros superiores da solução e colete o estrato leucocitário de dois mililitros na interfase. Adicione 12 mililitros de meio completo gelado ao isolado de células mononucleares e tampe o tubo para misturar por inversão.
Em seguida, pelote as células por centrifugação. Para corar as células para FACS, re-suspenda-as em 100 microlitros de anticorpo bloqueador CD1632FC a quatro graus Celsius. Após 10 minutos, lave as células em quatro mililitros de tampão de separação gelado e marque as células com 100 microlitros do coquetel apropriado de anticorpos para marcação da superfície celular.
Durante 15 minutos a quatro graus Celsius, no escuro. Lave as células com quatro mililitros de tampão de separação gelado para remover qualquer anticorpo conjugado com fluorescência não ligado. Em seguida, re-suspenda o pellet em 500 microlitros de solução de carregamento para FACS e transfira a amostra para um tubo de FACS sobre gelo.
Para corar os controles de compensação, alíquota uma vez 10 à sexta potência de esplenócitos por tubo. Lave as células com quatro mililitros de tampão de separação e re-suspenda os pellets em 100 microlitros de tampão de separação. Em seguida, adicione o anticorpo conjugado com fluoróforo apropriado do coquetel mestre de anticorpos de superfície celular a cada tubo de compensação correspondente e agite os tubos para misturar.
Após 15 minutos no escuro, a quatro graus Celsius, lave todas as amostras com tampão de separação e re-suspenda os pellets em 500 microlitros de tampão de separação gelado. Exceto o tubo de DAPI, que é re-suspenso em 500 microlitros de solução de carregamento para FACS. Para purificar a população celular alvo por meio de separação de células ativada por fluorescência, carregue tubos de coleta contendo 500 microlitros de FBS suplementado com antibióticos abaixo das válvulas de separação.
Em seguida, carregue o tubo não corado e colete 10.000 eventos para definir o portão negativo para cada intensidade fluorescente. E colete 10.000 eventos nos tubos de compensação com coloração simples para definir o portão positivo para cada intensidade fluorescente. Colete 3.000 eventos da amostra experimental para definir os portões da população celular classificada.
Utilizando as intensidades de fluorescência como parâmetros do gráfico nos eixos X e Y para selecionar manualmente a população de células-alvo. Em seguida, separar a população de células-alvo para o tubo de coleta. Ao final da separação, adicionar até quatro mililitros de meio completo gelado aos células.
Em seguida, tampe o tubo e misture as células por inversão. Peliculize as células purificadas por centrifugação, aspirando todo o sobrenatante, exceto os últimos 200 microlitros. Em seguida, re-suspenda o pellet em um mililitro de meio completo gelado e transfira as células para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro para uma segunda centrifugação.
Por fim, aspire todo o sobrenatante, exceto os últimos 100 microlitros, e armazene a população celular classificada em gelo até o uso. A separação celular ativada por campo magnético de células dendríticas plasmocitoides da medula óssea de camundongos predispostos ao lúpus resulta em apenas 7,75% de pureza após o enriquecimento. As células dendríticas plasmocitoides enriquecidas por FACS, no entanto, demonstram uma pureza tão alta quanto 96,4% após a classificação.
Para garantir uma alta pureza, as células mononucleares da medula óssea são primeiramente selecionadas e separadas dos detritos por meio dos parâmetros de dispersão para a frente e dispersão lateral. Utilizando a largura da dispersão para a frente versus a altura da dispersão para a frente e a largura da dispersão lateral versus a altura da dispersão lateral, as células individuais são ainda mais selecionadas para evitar sinais falsos positivos produzidos por agregados. As células únicas vivas negativas para DAPI são então selecionadas pela sua expressão positiva para CD11c e negativa para CD11B na superfície celular, permitindo a seleção adicional da população-alvo de células dendríticas plasmocitoides da medula óssea positivas para B220 e PDCA-1.
A população de PDCs ordenada não é apenas de alta pureza, mas também funcionalmente normal, com a capacidade de produzir IFNalpha após estimulação com CPG in vitro. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de quebrar os ossos e agitar suavemente a medula óssea liberada para preservar a viabilidade celular. Após este procedimento, outros métodos como sequenciamento de RNA ou cultura e estimulação in vitro podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a expressão gênica ou a função de populações celulares enriquecidas.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores de PDC explorassem o papel dessa célula poderosa no desenvolvimento do lúpus e de modelos murinos predispostos ao lúpus. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar uma população altamente purificada de PDC da medula óssea de camundongos predispostos ao lúpus.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para o isolamento de células dendríticas plasmocitoides (pDC) da medula óssea de camundongos predispostos ao lúpus utilizando triagem celular ativada por fluorescência. O método tem como objetivo alcançar alta pureza para estudos funcionais subsequentes das pDC.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Autoimunidade
Contexto
- As células dendríticas plasmocitoides são cruciais para as respostas imunes.
- Elas produzem interferon alfa, especialmente durante a progressão do lúpus.
- O isolamento de alta pureza é essencial para uma análise funcional precisa.
- A triagem de células ativada por fluorescência oferece vantagens em relação aos métodos tradicionais.
Objetivo do Estudo
- Isolar pDC de camundongos predispostos ao lúpus.
- Estudar as características funcionais de pDC.
- Aprimorar o entendimento do comportamento das células imunes no lúpus.
Métodos Utilizados
- Coleta de medula óssea de camundongos predispostos ao lúpus.
- Uso da triagem de células ativada por fluorescência para isolamento.
- Preparação do meio completo para o processamento celular.
- Fraturamento de ossos para liberar células destinadas à triagem.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de pDC com alta pureza.
- Melhor compreensão da função das pDC no lúpus.
- Demonstração das vantagens da triagem de células ativada por fluorescência.
- Oferecimento de um protocolo confiável para estudos futuros.
Conclusões
- O protocolo isola efetivamente pDC para estudos funcionais.
- Os achados contribuem para a compreensão da patologia do lúpus.
- A pesquisa futura pode se basear nesta metodologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de populações raras de células imunes com alta pureza é fundamental para a desmistificação mecanicista na validação de alvos e no desenvolvimento de modelos pré-clínicos. A triagem de células ativada por fluorescência (FACS) permite a separação fenotípica precisa de células dendríticas plasmocitoides da medula óssea de camundongos predispostos ao lúpus, apoiando ensaios funcionais confiáveis e a descoberta de biomarcadores translacionais. Essa abordagem reduz o ruído biológico na fase inicial da descoberta, melhorando a confiabilidade preditiva para testes de hipóteses terapêuticas subsequentes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite investigar a função das células dendríticas plasmocitoides na patogênese do lúpus ao isolar uma população pura para estudos de produção de interferon alfa.
- Valor Operacional: Alcança até 96,4% de pureza após a classificação, superando significativamente as alternativas de separação celular por ativação magnética.
- Valor Estratégico: Apoia a confiança no alvo ao reduzir a heterogeneidade celular em leituras funcionais, auxiliando decisões de avanço ou interrupção na triagem de imunomoduladores.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera células dendríticas plasmocitoides purificadas adequadas para ensaios de estimulação in vitro, como a medição de alfa-interferon induzida por CpG.
- Valor Operacional: Permite a separação simultânea de múltiplas populações celulares, aumentando a produtividade experimental e a padronização dos ensaios.
- Valor Estratégico: Cria uma entrada reprodutível para fluxos de triagem, permitindo a avaliação confiável de compostos frente a fenótipos imunes definidos.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: Fornece um sistema relevante para a doença utilizando modelos de camundongos predispostos ao lúpus para estudar as contribuições das células dendríticas plasmocitoides na autoimunidade.
- Valor Operacional: As células isoladas permanecem funcionalmente normais, capazes de produzir interferon alfa após estimulação, validando a prontidão do ensaio.
- Valor Estratégico: Facilita a continuidade translacional do descobrimento à validação pré-clínica, fornecendo células primárias bem caracterizadas para estudos de mecanismo de ação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, apoiando a validação inicial de alvos por meio de triagem fenotípica e permitindo a identificação de compostos líderes por meio de leituras funcionais em células imunes purificadas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante o isolamento de células dendríticas plasmocitoides para esclarecer seu papel na patologia do lúpus mediada por interferon.
- Triagem: Fornece populações celulares padronizadas e de alta pureza para ensaios funcionais reprodutíveis e triagem de compostos.
- Análises: Permite medições quantitativas de variáveis dependentes, como produção de citocinas, leituras de citometria de fluxo e avaliação de pureza por meio de comportamento de dispersão direta/lateral.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio do uso de camundongos predispostos ao lúpus, alinhando-se à desmistificação mecanicista em modelos de doenças autoimunes.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade reutilizável para o isolamento de células imunes raras em diversos projetos de imunologia e autoimunidade.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da redução da ambiguidade mecanicista em estudos da função de células imunes.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de estratégias definidas de seleção de eventos e controles de compensação.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais precisas sobre continuidade ou interrupção de projetos e redução de riscos biológicos em estágios avançados no desenvolvimento de imunomoduladores.
- Impacto sobre o Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base em dados pré-clínicos confiáveis obtidos de populações celulares purificadas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em citometria de fluxo, coloração celular e controles de compensação para a triagem precisa de células ativadas por fluorescência.
- Depende de instrumentação, incluindo citômetros de fluxo, equipamentos de separação e sistemas de centrifugação para o processamento da medula óssea.
- Necessita padronização entre equipes de painéis de anticorpos, estratégias de seleção e protocolos de separação entre grupos de imunologia e desenvolvimento de ensaios.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o protocolo a outros sistemas modelo ou fontes de tecidos além da medula óssea de camundongo.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de disruptura suave da medula óssea para preservar a viabilidade celular e a natureza demorada da purificação em múltiplas etapas.
