Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocit�des do rato de Medula Óssea

O objetivo geral deste experimento é isolar células dendríticas plasmocitóides, ou PDC, com alta pureza da medula óssea de camundongos propensos ao lúpus para o estudo de sua função. Este método pode ajudar a responder a questões-chave relacionadas às características de uma determinada população de células imunes, como interferon alfa produzindo PDC durante o estágio final do desenvolvimento do lúpus. A principal vantagem dessa técnica é que uma a várias populações-alvo podem ser enriquecidas a uma pureza maior do que pela classificação magnética de contas.

Após a colheita, transfira os ossos dos membros posteriores e quatro mililitros de meio completo para um pilão. Adicione seis mililitros de meio completo fresco para elevar o volume total para 10 mililitros. E quebre os ossos suavemente com um pilão.

Mexa suavemente o pilão para liberar a medula óssea. Em seguida, transfira todo o meio através de uma peneira de 70 mícrons para um tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Adicione 10 mililitros de meio completo fresco à argamassa.

E filtre o sobrenadante mais duas vezes até que os ossos pareçam brancos. Em seguida, centrifugue as células da medula óssea e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio completo fresco. Em seguida, coloque as células em camadas em cinco mililitros de meio gradiente de densidade recém-preparado em um tubo cônico de 15 mililitros, tomando cuidado para não romper as camadas.

E separe as células por centrifugação. Em seguida, remova cuidadosamente os oito mililitros superiores da solução e colete a camada buffy de dois mililitros na interfase. Adicione 12 mililitros de meio completo gelado às células mononucleares isoladas e tampe o tubo para misturar por inversão.

Em seguida, peletize as células por centrifugação. Para corar as células para FACS, ressuspenda-as em 100 microlitros de anticorpo bloqueador de CD1632FC a quatro graus Celsius. Após 10 minutos, lave as células em quatro mililitros de tampão de classificação gelado e rotule as células com 100 microlitros do coquetel de anticorpos de coloração de superfície celular apropriado.

Por 15 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Lave as células em quatro mililitros de tampão de classificação gelado para remover qualquer anticorpo conjugado de fluorescência não ligado. Em seguida, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de solução de carregamento FACS e transfira a amostra para um tubo FACS no gelo.

Para corar os controles de compensação, alíquota uma vezes 10 a sextos esplenócitos por tubo. Lave as células com quatro mililitros de tampão de triagem e ressuspenda os pellets em 100 microlitros de tampão de triagem. Em seguida, adicione o anticorpo conjugado de fluorescência apropriado do coquetel de anticorpos de superfície da célula mestre a cada tubo de compensação correspondente e agite os tubos para misturar.

Após 15 minutos no escuro, a quatro graus Celsius, lave todas as amostras com tampão de classificação e ressuspenda os pellets em 500 microlitros de tampão de classificação gelado. Exceto para o tubo DAPI, que é ressuspenso em 500 microlitros de solução de carregamento FACS. Para purificar a população de células-alvo por classificação de células ativadas por fluorescência, carregue tubos de coleta contendo 500 microlitros de FBS suplementados com antibióticos abaixo das válvulas de classificação.

Em seguida, carregue o tubo não corado e colete 10.000 eventos para definir a porta negativa para cada intensidade fluorescente. E 10.000 eventos nos tubos de compensação de mancha única para definir a porta positiva para cada intensidade fluorescente. Colete 3.000 eventos da amostra experimental para definir as portas da população de células classificadas.

Usando as intensidades de fluorescência como parâmetros do gráfico de acesso X e Y para bloquear manualmente a população de células-alvo. Em seguida, classifique a população de células-alvo no tubo de coleta. No final da triagem, adicione até quatro mililitros de meio de gelo completo às células.

Em seguida, tampe o tubo e misture as células por inversão. Pulverize as células purificadas por centrifugação, aspirando todos, exceto os últimos 200 microlitros do sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo gelado e transfira as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para uma segunda centrifugação.

Finalmente, aspire todos, exceto os últimos 100 microlitros do sobrenadante e armazene a população de células classificadas no gelo até o uso. A classificação celular ativada magnética de células dendríticas plasmocitóides da medula óssea de camundongos propensos ao lúpus resulta em apenas 7,75% de pureza após o enriquecimento. As células dendríticas plasmocitóides enriquecidas com FACS, no entanto, demonstram uma pureza de até 96,4% após a classificação.

Para garantir uma alta pureza, as células mononucleares da medula óssea são primeiro fechadas e separadas dos detritos por parâmetros de dispersão direta e lateral. Usando a largura de dispersão direta versus a altura de dispersão direta e a largura de dispersão lateral versus a altura de dispersão lateral, as células individuais são ainda mais fechadas para evitar os sinais falsos positivos produzidos por agregados. As células vivas DAPI negativas são então bloqueadas por sua expressão de superfície celular CD11c positiva e CD11B negativa, permitindo um maior bloqueio da população de células dendríticas plasmocitoides da medula óssea alvo B220 positivo e PDCA-1

A população de PDC classificada não é apenas de alta pureza, mas também funcionalmente normal, com a capacidade de produzir IFNalfa após estimulação CPG in vitro. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de quebrar os ossos e agitar a medula óssea liberada suavemente para preservar a viabilidade celular. Após este procedimento, outros métodos, como sequenciamento de RNA ou cultura e estimulação in vitro, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a expressão gênica ou função de populações de células enriquecidas.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores do PDC explorarem o papel dessa poderosa célula no desenvolvimento de modelos de camundongos propensos ao lúpus e ao lúpus. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar uma população de PDC altamente purificada da medula óssea de camundongos propensos ao lúpus.