Detecção de aderência bacteriana às células hospedeiras usando imagens de fluorescência

Pegue uma placa de vários poços contendo monocamada de células epiteliais aderentes suscetíveis à aderência bacteriana.

Adicione números variados de Pseudomonas aeruginosa marcada com proteína fluorescente, uma bactéria patogênica, para atingir a proporção desejada de bactérias para células epiteliais.

Centrifugue para aproximar as bactérias das células epiteliais, facilitando as interações.

Os pili tipo IV, fibras proteicas da bactéria, desempenham um papel fundamental ao se ligarem a glicolipídios específicos nas células epiteliais, mediando a adesão bacteriana às células hospedeiras.

Pós-incubação, lave com um tampão para remover as bactérias não aderentes. Fixe as células para preservar a estrutura celular.

Adicione DAPI, uma coloração fluorescente que se liga fortemente às regiões de DNA ricas em A-T, corando o núcleo. Cubra as células com tampão para evitar o ressecamento das células.

Adquira imagens das bactérias marcadas com GFP ligadas a células epiteliais com núcleo corado com DAPI. Enumere as bactérias aderentes em uma única célula epitelial.

O aumento de bactérias aderentes por célula hospedeira de maneira dose-dependente permite a quantificação das interações patógeno-hospedeiro.

Para o ensaio de aderência bacteriana, lave as monocamadas de células A549 previamente cultivadas três vezes, adicionando 100 microlitros de PBS quente a cada poço e pipete suavemente para cima e para baixo. Em seguida, descarte o PBS. Alternativamente, depois de adicionar PBS, aguarde dez segundos e, em seguida, remova o PBS usando vácuo.

Para determinar a cinética da associação bacteriana, cubra as células com 100 microlitros de concentrações desejadas de suspensão bacteriana com diferentes multiplicidades de infecção. Gire as bactérias e incube as células A549 infectadas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por mais uma hora. Remova as bactérias não ligadas lavando as monocamadas cinco vezes com PBS quente, conforme demonstrado.

Em seguida, fixe as células adicionando 100 microlitros de formaldeído a 4% em todos os poços de uma placa de 96 poços no gelo. Após 15 minutos, lavar a placa três vezes com PBS para remover a solução de fixação, corando os núcleos com 50 nanogramas por mililitro de DAPI por 10 minutos à temperatura ambiente.

Depois de lavar as células com PBS, cubra as células A549 infectadas com 100 microlitros de PBS para evitar a secagem e, em seguida, armazene a placa a 4 graus Celsius por até dois dias no escuro ou prossiga para a imagem.