Geração de um modelo de camundongo de malária cerebral experimental usando esporozoítos derivados de mosquitos hospedeiros

Comece com um tubo contendo glândulas salivares de mosquitos fêmeas infectados com Plasmodium berghei - um parasita causador da malária.

Rompe mecanicamente as glândulas, liberando os esporozoítos - uma forma infecciosa do parasita no meio.

Pulverize as frações e detritos da glândula. Colete o sobrenadante contendo esporozoíto e injete-o na veia da cauda de um camundongo contido.

Os esporozoítos injetados viajam pela corrente sanguínea e chegam ao fígado, onde infectam os hepatócitos e se multiplicam, formando merozoítos - uma forma invasiva do parasita.

Com o tempo, os hepatócitos liberam merozoítos na corrente sanguínea, invadindo os glóbulos vermelhos, ou hemácias.

Dentro das hemácias, os merozoítos se replicam assexuadamente, desenvolvendo-se na forma madura e expressando antígenos derivados do parasita na superfície das hemácias.

Esses antígenos se ligam aos receptores endoteliais, incluindo aqueles nos vasos sanguíneos cerebrais, levando ao sequestro de hemácias infectadas e não infectadas.

Esse acúmulo anormal de hemácias interrompe a barreira hematoencefálica, causando acúmulo de líquido no parênquima do cérebro e desenvolvendo malária cerebral no camundongo.

Comece coletando mosquitos fêmeas de sua gaiola 17 a 22 dias após a refeição de sangue. Use uma pinça para colocar 3 a 4 mosquitos em uma lâmina de vidro coberta com uma gota de meio RPMI frio. Em seguida, coloque a lâmina sob um microscópio.

Estique cuidadosamente o mosquito entre a cabeça e o corpo com uma pinça e use uma seringa e uma agulha para isolar a glândula salivar. Em seguida, colete as glândulas salivares da lâmina de vidro, sugando-as com uma pipeta de vidro e transferindo-as para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, use um pequeno bastão de plástico para esmagar as glândulas salivares isoladas dentro do tubo de centrífuga por três minutos, a fim de isolar os esporozoítos do tecido da glândula salivar.

Centrifugue por três minutos a 1.000 vezes g em 4 graus Celsius para purificar os esporozoítos do tecido restante. Pipete o sobrenadante, que contém os esporozoítos, para um novo tubo de centrífuga e conte os esporozoítos purificados em um hemocitômetro Neubauer. Os esporozoítos mostram um movimento típico no sentido anti-horário.

Em seguida, ajuste a concentração dos esporozoítos purificados para 10.000 por mililitro adicionando solução salina tamponada com fosfato. Por fim, coloque um camundongo C57BL6 em um limitador e coloque sua cauda em água morna para visualizar melhor a veia da cauda. Em seguida, injete um total de 1.000 esporozoítos, ou 0,1 mililitros, na veia da cauda para iniciar a infecção.