Avaliando a eficácia de um composto de teste antiviral por meio de um ensaio de inativação viral

Pegue tubos com um vírus da hepatite C recombinante ou suspensão de HCV contendo RNA que codifica um repórter de luciferase secretado.

Adicione um composto de teste antiviral e solvente aos tubos de teste e controle negativo.

Os compostos de teste se ligam às glicoproteínas do HCV, inativando o vírus.

Após a incubação, dilua as misturas para evitar interações composto-célula nas etapas subsequentes.

Adicione essas misturas diluídas em monocamadas de hepatoma que suportam a replicação do HCV. Incubar.

O HCV inativado pelo composto não pode se ligar a receptores específicos da superfície celular, enquanto as glicoproteínas ativas do HCV se ligam a esses receptores, facilitando a ligação celular.

Remova os HCVs não adsorvidos. Lave com tampão e adicione a mídia. Incubar por um período prolongado.

O HCV ligado é internalizado, liberando RNA viral e levando à síntese de proteína viral e luciferase, secretada pela célula.

Colete os sobrenadantes de cultura contendo luciferase. Centrifugue e adicione um substrato de luciferase aos sobrenadantes.

A luciferase oxida o substrato, emitindo luz.

Uma luminescência mais alta no poço de controle do que no teste indica inativação viral pelo composto.

Para iniciar o ensaio de inativação viral, primeiro, coloque 1 vezes 10 elevado a 10 células por poço em uma placa de 96 poços. Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a noite para fixação. Para infecção, prepare Gaussia luciferase com o vírus da hepatite C marcado com repórter ou partículas de HCV, conforme mencionado no protocolo de texto.

Em um tubo estéril, misture 100 microlitros de CHLA ou PUG 100 micromolar com 100 microlitros de 10 para a quarta unidade formadora de foco ou FFU de HCV. Para um controle positivo, misture o HCV com heparina na concentração final de 1.000 microgramas por mililitro. Incube a 37 graus Celsius por três horas.

Após três horas, dilua a mistura do composto do vírus 50 vezes com 9,8 mililitros de meio basal em temperatura ambiente. Em seguida, prepare uma nova mistura de compostos de vírus e dilua imediatamente essa mistura em meio basal para a amostra de incubação de zero hora. Depois de remover o meio de incubação das células, adicione 100 microlitros da solução diluída do medicamento viral por poço em triplicata.

A solução agora contém 10 elevado à segunda FFU por poço. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três horas para permitir a infecção viral das células. Após a incubação, remova a suspensão viral dos poços e lave suavemente as células com 200 microlitros de PBS duas vezes.

Incubar as células em 100 microlitros de meio basal por 72 horas para replicação viral e liberação de luciferase repórter no sobrenadante. Em seguida, colete os sobrenadantes das culturas em microtubos e centrifugue a 17.000 vezes g por 5 minutos a 4 graus Celsius para remover os detritos celulares. Misture 20 microlitros de cada sobrenadante com 50 microlitros de reagente de ensaio de luciferase Gaussia e meça a luminescência da atividade repórter de luciferase em um luminômetro.