Um método baseado em imunofluorescência para quantificar o estresse de replicação em células cancerígenas

Comece com células cancerígenas carregando IdU, um substituto sintético do nucleotídeo timidina, já integrado em seu DNA. Quando essas células encontram estresse de replicação, sua síntese de DNA é interrompida, revelando IdU dentro de regiões de DNA de fita simples expostas.

Fixe as células e adicione moléculas de detergente para tornar a membrana celular permeável.

Adicione BSA para bloquear locais de ligação de anticorpos não-alvo.

Introduzir anticorpos anti-IdU que interagem com o DNA de fita simples marcado com IdU.

Adicione anticorpos secundários marcados com fluoróforo verde que têm como alvo anticorpos anti-IdU. Remova os anticorpos não ligados.

Coloque a lamínula em uma lâmina contendo um meio de montagem com um corante fluorescente - que mancha os núcleos.

Sob um microscópio de fluorescência, observe os núcleos azuis.

Os focos de fluorescência verde representam anticorpos que se ligam ao DNA de fita simples.

Conte o número de focos para quantificar o nível de estresse de replicação.

Adicione 1 mililitro de suspensão celular em lamínulas de poli-L-lisina colocadas nos poços de uma placa de 24 poços e cultive as células no meio de cultura em condições padrão. Após uma dupli