$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Comece com células cancerígenas carregando IdU, um substituto sintético do nucleotídeo timidina, já integrado em seu DNA. Quando essas células encontram estresse de replicação, sua síntese de DNA é interrompida, revelando IdU dentro de regiões de DNA de fita simples expostas.
Fixe as células e adicione moléculas de detergente para tornar a membrana celular permeável.
Adicione BSA para bloquear locais de ligação de anticorpos não-alvo.
Introduzir anticorpos anti-IdU que interagem com o DNA de fita simples marcado com IdU.
Adicione anticorpos secundários marcados com fluoróforo verde que têm como alvo anticorpos anti-IdU. Remova os anticorpos não ligados.
Coloque a lamínula em uma lâmina contendo um meio de montagem com um corante fluorescente - que mancha os núcleos.
Sob um microscópio de fluorescência, observe os núcleos azuis.
Os focos de fluorescência verde representam anticorpos que se ligam ao DNA de fita simples.
Conte o número de focos para quantificar o nível de estresse de replicação.
Adicione 1 mililitro de suspensão celular em lamínulas de poli-L-lisina colocadas nos poços de uma placa de 24 poços e cultive as células no meio de cultura em condições padrão. Após uma duplicação da população, aspire o meio existente da placa e pulse as células com 10 IdU micromolares para as duas duplicações populacionais subsequentes.
Para colher as células, substitua o meio por PBSTx 0,5% gelado no gelo por 5 minutos. Para fixação das células, aspire PBSTx e incube as células por 15 minutos com paraformaldeído a 3% à temperatura ambiente. Após 3 a 4 lavagens com PBS, mantenha as células fixas a 4 graus Celsius até o uso posterior.
Após a fixação, permeabilize as células usando PBSTx a 0,5% no gelo por 5 minutos, garantindo a cobertura de toda a lamínula. Após lavar as células 3 a 4 vezes com 1 mililitro de PBST a 0,2% à temperatura ambiente, aspire o PBST e bloqueie as amostras, usando 5% de BSA feito em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente.
Para imunocoloração, prepare uma câmara umidificada colocando uma toalha de papel molhada em um Tupperware de fundo plano. Cubra a tampa da placa de 24 poços com parafilme. Coloque-o na câmara umidificada e coloque as lamínulas na tampa da placa. Adicione 60 microlitros de anticorpo primário de camundongo anti-BrdU diluído, na parte superior da lamínula.
Alternativamente, para reduzir o anticorpo da secagem e usar menos volume, coloque uma gota de anticorpo diluído no parafilme e vire a lamínula sobre ele. Em seguida, incube por 1 hora a 37 graus Celsius. Após a incubação, aspire o anticorpo primário.
Retorne as lamínulas de volta para uma placa de 24 poços e lave-as com 0,2% de PBST 4 vezes. Adicione anticorpo secundário diluído na lamínula, conforme demonstrado anteriormente, e incube por uma hora no escuro à temperatura ambiente. Rotule uma lâmina de microscópio e monte a lamínula nas lâminas com o meio de montagem DAPI. Armazene as lâminas no escuro em temperatura ambiente por 24 horas se o meio de montagem precisar ser curado ou endurecido.