Um método de imunocoloração multiplex usando anticorpos primários da mesma espécie hospedeira

Pegue uma seção adrenal fixa e permeabilizada compreendendo um córtex e uma medula. Trate-o com um tampão ácido fervente, quebrando as ligações cruzadas induzidas pela fixação para desmascaramento do antígeno.

Bloqueie os locais de ligação não específicos e introduza anticorpos primários ligando-se a marcadores específicos do córtex.

Adicione anticorpos secundários biotinilados direcionados aos anticorpos primários e peroxidases conjugadas com estreptavidina que se ligam à biotina.

Introduza uma tiramida marcada com fluoróforo e peróxido de hidrogênio.

As peroxidases imobilizadas utilizam peróxido de hidrogênio para ativar a tiramida, que se liga a proteínas próximas, marcando o córtex.

Em seguida, trate a seção com o tampão de ebulição para remover os anticorpos ligados.

Introduzir os mesmos anticorpos primários gerados pela espécie hospedeira visando marcadores específicos da medula e anticorpos secundários biotinilados.

Introduza peroxidases conjugadas com estreptavidina e uma tiramida conjugada com fluoróforo diferente para marcar a medula.

A remoção dos anticorpos primários específicos do córtex inibe o anticorpo secundário reintroduzido que os liga, impedindo a reatividade cruzada.

Aplique uma coloração nuclear e realize imagens para visualizar o córtex e a medula distintamente corados, confirmando que não há reatividade cruzada de anticorpos.

Antes da coloração, desparafine e reidratar lâminas fixadas em formalina e embebidas em parafina com imersões de cinco minutos em cada solução, conforme indicado. Após a segunda imersão em água destilada, coloque as lâminas em 275 mililitros de solução fervente de citrato de sódio no fundo de uma caixa de ponteira de pipeta com tampa e coloque a caixa em um micro-ondas de 700 watts com 70% de potência por oito minutos.

No final do tratamento, abra a tampa e deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente antes de lavar as lâminas com três lavagens de cinco minutos de PBST fresco em um frasco Coplin. Para bloquear quaisquer locais de ligação inespecíficos, após a última lavagem, agite o excesso de PBST de cada lâmina e cubra as lâminas com um volume suficiente de uma solução de bloqueio apropriada.

Após 30 minutos em temperatura ambiente em uma câmara umidificada, agite o excesso de solução de bloqueio de cada lâmina e adicione 250 microlitros do primeiro anticorpo primário de interesse a cada amostra. Para evitar que as amostras sequem, as lâminas podem ser cobertas por um pedaço de filme de parafina.

Após uma incubação noturna a quatro graus Celsius na câmara umidificada, lave as lâminas três vezes com PBST fresco por cinco minutos por lavagem. Sacuda o excesso de PBST e, em seguida, cubra rapidamente cada lâmina com 250 microlitros de uma solução de anticorpos secundários apropriada para uma incubação de uma hora na câmara umidificada à temperatura ambiente.

No final da incubação, lave as lâminas três vezes em PBST fresco, conforme demonstrado, e adicione 250 microlitros de estreptavidina peroxidase de rábano recém-preparada a cada lâmina. Após 30 minutos à temperatura ambiente, lave as lâminas três vezes em PBST fresco, depois sacuda o excesso de PBST e cubra cada lâmina com 250 microlitros de solução de tiramida de fluoróforo recém-preparada.

Um minuto depois, mergulhe as lâminas em PBST fresco, seguido por três lavagens de dois minutos em PBST fresco. Após a última lavagem, aplique algumas gotas de uma solução de glicerol 1 para 1 em PBS nas seções e verifique a presença de um sinal fluorescente por microscopia de fluorescência.

Para remover o primeiro complexo de anticorpos, coloque as lâminas marcadas com anticorpos em 275 mililitros de solução fervente de citrato de sódio por pelo menos oito minutos, conforme demonstrado. No final do tratamento, abra a tampa e deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente, antes de lavar as lâminas três vezes com PBST por cinco minutos por lavagem.

Para corar a segunda proteína-alvo de interesse, após a demonstração do bloqueio da ligação inespecífica, rotule cada amostra com 250 microlitros do segundo anticorpo primário de interesse a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, lave as lâminas três vezes por cinco minutos em PBST fresco por lavagem antes de cobrir cada lâmina com 250 microlitros de uma solução de anticorpos secundários apropriada para uma incubação de uma hora em temperatura ambiente.

No final da incubação, lave as lâminas três vezes em PBST fresco, conforme demonstrado, e adicione 250 microlitros de estreptavidina peroxidase de rábano recém-preparada a cada lâmina. Para desenvolver o sinal para a segunda proteína-alvo de interesse após três lavagens de PBST, trate as lâminas com uma tiramida conjugada com fluoróforo em um espectro fluorescente diferente.

Para interromper o desenvolvimento do sinal de tiramida, mergulhe as lâminas em PBST e comente as amostras com um corante nuclear apropriado.