Um método de imunocoloração multiplex usando anticorpos primários da mesma espécie hospedeira

Pegue uma seção adrenal fixa e permeabilizada compreendendo um córtex e uma medula. Trate-o com um tampão ácido fervente, quebrando as ligações cruzadas induzidas pela fixação para desmascaramento do antígeno.

Bloqueie os locais de ligação não específicos e introduza anticorpos primários ligando-se a marcadores específicos do córtex.

Adicione anticorpos secundários biotinilados direcionados aos anticorpos primários e peroxidases conjugadas com estreptavidina que se ligam à biotina.

Introduza uma tiramida marcada com fluoróforo e peróxido de hidrogênio.

As peroxidases imobilizadas utilizam peróxido de hidrogênio para ativar a tiramida, que se liga a proteínas próximas, marcando o córtex.

Em seguida, trate a seção com o tampão de ebulição para remover os anticorpos ligados.

Introduzir os mesmos anticorpos primários gerados pela espécie hospedeira visando marcadores específicos da medula e anticorpos secundários biotinilados.

Introduza peroxidases conjugadas com estreptavidina e uma tiramida conjugada com fluoróforo diferente para marcar a medula.

A remoção dos anticorpos primários específicos do córtex inibe o anticorpo secundário reintroduzido que os liga, impedindo a reatividade cr