Purificação de células precursoras endoteliais CD31⁺ usando classificação de células ativadas por magnetismo

Faça uma cultura aderente de células progenitoras endoteliais ou EPCs, precursoras das células endoteliais microvasculares cerebrais.

A cultura, obtida pela diferenciação de células-tronco pluripotentes, compreende CPE positivas para o marcador de superfície CD31 e células CD31 negativas contaminantes.

Incubar com um reagente de dissociação para separar as células e filtrar para obter uma suspensão unicelular.

Adicione um meio para neutralizar as enzimas, centrifugue para descartar o sobrenadante e ressuspenda as células em um tampão.

Incubar com um reagente bloqueador para inibir os receptores Fc celulares, evitando a marcação inespecífica.

Adicione um anticorpo conjugado com fluoróforo específico para CD31 e incube para marcar os EPCs.

Centrifugue e descarte anticorpos não ligados. Incubar com complexos de anticorpos contendo um anticorpo que se liga aos fluoróforos.

Introduza nanopartículas magnéticas revestidas com polímero e incuba, permitindo que as nanopartículas se liguem ao segundo anticorpo dos complexos.

Usando um campo magnético, isole as células ligadas a nanopartículas.

Rejeitar a suspensão com células CD31 negativas não marcadas e ressuspender as células purificadas num meio. Os EPCs positivos para CD31 estão prontos para ensaios a jusante.

No dia 5 da cultura de células progenitoras endoteliais, aspire o meio dos poços e adicione 1 mililitro de reagente de dissociação a cada poço. Incube a placa por 6 a 8 minutos a 37 graus Celsius. Usando uma micropipeta, dissocie e singularize as células e, em seguida, passe a suspensão celular por um filtro de células de 40 micrômetros para filtrar em um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de meio DMEM / F-12.

Para interromper a reação de digestão, adicione o meio DMEM/F-12/10 10 até a marca de 50 mililitros. Pipete bem e reserve 10 microlitros para contar as células. Centrifugue o tubo de 50 mililitros a 200 g por 5 minutos a 20 a 25 graus Celsius para peletar as células. Após centrifugação, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular com 10 mililitros de meio DMEM/F-12/10.

Transfira a suspensão celular para um novo tubo de 15 mililitros. Centrifugue a 200 g por cinco minutos a 20 a 25 graus Celsius para peletizar as células novamente. Em seguida, ressuspenda o pellet de célula no tampão de fluxo 1. Em seguida, adicione o reagente de bloqueio FcR na proporção de 1 para 100 e incube por 5 minutos. Em seguida, adicione o isotiocianato de fluoresceína diluído na proporção de 1 para 200 ou o anticorpo CD31 marcado com FITC.

Incubar a suspensão durante 30 minutos no escuro a uma temperatura entre 20 e 25 graus Celsius. No final da incubação, adicione 10 mililitros de tampão de fluxo 1 à amostra e reserve 10 microlitros da suspensão para análise de citometria de fluxo para determinar a fração de células CD31-positivas. Centrifugue as células a 200 g por 5 minutos a 20 a 25 graus Celsius. Após centrifugação, ressuspender as células com solução tampão de fluxo 1.

Em seguida, adicione 5 microlitros do coquetel de seleção FITC por 100 microlitros da suspensão celular. Misturar bem a solução pipetando e incubar na escura durante 15 minutos a uma temperatura entre 20 e 25 graus Celsius. Em seguida, adicione 5 microlitros de nanopartículas magnéticas por 100 microlitros de suspensão celular. Pipete bem a mistura e incube no escuro por 10 minutos a 20 a 25 graus Celsius.

Transfira a suspensão celular para um tubo de citometria de fluxo de 5 mililitros e adicione o tampão de fluxo 1 para obter um volume total de 2,5 mililitros. Em seguida, coloque o tubo de citometria de fluxo no ímã por cinco minutos. Em um movimento contínuo, inverta o ímã e transvase a suspensão celular contendo células não marcadas com anticorpos FITC-CD31. Mantenha o ímã e o tubo na posição invertida por 2 a 3 segundos e, em seguida, remova o líquido restante.

Aspire todas as gotículas na borda do tubo antes de retornar o tubo para a posição vertical. Recupere o tubo de citometria de fluxo do ímã e adicione 2,5 mililitros de tampão de fluxo 1 para lavar as células CD31-positivas restantes. Pipete suavemente as células para cima e para baixo, duas ou três vezes para ressuspendê-las. Em seguida, coloque o tubo de fluxo no ímã por cinco minutos.

Repita a lavagem pelo menos quatro vezes para remover as células não marcadas com FITC-CD31 do tubo. Remova o tubo de fluxo do ímã e ressuspenda as células CD31-positivas purificadas com a quantidade desejada de um meio adequado. Reserve duas alíquotas de 1 microlitro da suspensão, uma para contagem de células e a segunda para realizar a análise de citometria de fluxo para avaliar a pureza das células CD31-positivas em amostras de classificação de células ativadas pós-magnéticas.