Indução in vitro de junções neuromusculares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos projetadas

Comece com iPSCs humanas projetadas contendo um gene induzível por doxiciclina de diferenciação de mioblastos ou codificação de proteína MYOD em um meio de células-tronco contendo inibidores de Rho-quinase.

Transfira as células para placas revestidas com ECM e incube para promover a fixação celular.

Enquanto isso, o inibidor inativa as enzimas Rho-quinase intracelulares, aumentando a viabilidade celular.

Substitua o meio por um meio de células-tronco contendo doxiciclina.

A doxiciclina entra nas células e se liga às proteínas ativadoras. Esses complexos se ligam ao promotor, induzindo a expressão gênica em algumas células e produzindo proteínas MIOD, que desencadeiam a diferenciação de células-tronco em células musculares.

Trate as células com um meio de diferenciação miogênica contendo fatores de diferenciação miogênica para promover a formação de miotubos, uma célula muscular multinucleada.

Mais tarde, introduza um meio de indução neural com fatores de crescimento neural.

Esses fatores diferenciam as iPSCs restantes em neurônios motores e células de Schwann que formam uma bainha de mielina ao redor dos neurônios.

Finalmente, substitua o meio por um meio de junção neuromuscular para promover conexões entre o neurônio motor e o miotubo, formando junções neuromusculares.

Lave as células com 3 mililitros de PBS antes de adicionar 1 mililitro de solução de descolamento de células a uma placa de Petri. Após 10 minutos a 37 graus Celsius, adicione 3 mililitros de meio de células-tronco embrionárias de primatas a cada poço e pipete suavemente três vezes para dissociar as células das lamínulas.

Em seguida, agrupe a célula-tronco destacada contendo sobrenadantes em um tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação e ressuspenda o pellet de células-tronco em 3 mililitros de meio de células-tronco embrionárias de primatas frescos suplementado com inibidor de ROCK Y27632 10 micromolar para contagem.

Em seguida, dilua as células para 2 x 10⁵ células por mililitro de meio, suplementado com concentração de inibidor de ROCK, e retorne 2 mililitros de células para cada lamínula em cada poço da placa de 6 poços revestida com matriz extracelular.

Após 24 horas, substitua o sobrenadante em cada poço por 2 mililitros de meio de células-tronco embrionárias de primatas frescos suplementado com 1 micrograma por mililitro de doxiciclina e retorne a placa à incubadora de cultura de células por 24 horas.

No final da incubação, substitua os sobrenadantes por 2 mililitros de meio de diferenciação suplementado com doxiciclina por alvéolo e retorne a placa à incubadora de cultura de células por 10 dias.

No final da incubação, substitua os sobrenadantes por 2 mililitros de meio de diferenciação miogênica suplementado com doxiciclina por poço e retorne a placa à incubadora de cultura de células por mais 10 dias. No final da incubação, substitua os sobrenadantes por 2 mililitros de meio de junção neuromuscular por poço e retorne a placa à incubadora de cultura de células por 30 dias.