Diferenciando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em neurônios motores funcionais

Pegue as colônias de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, ou iPSC, cultivadas em uma placa revestida com matriz extracelular.

As iPSCs são geneticamente modificadas para expressar fatores de transcrição que induzem a diferenciação do neurônio motor.

Remova o meio e adicione enzimas para separar as colônias.

Dissocie mecanicamente as células em uma suspensão unicelular e colete-as.

Centrifugue e remova o sobrenadante.

Ressuspenda as células em meios contendo um inibidor que previne a apoptose celular.

Coloque as células em um prato revestido com matriz.

Adicione meios de diferenciação frescos contendo o antibiótico doxiciclina e inibidores de moléculas pequenas.

A doxiciclina induz a expressão do fator de transcrição, enquanto os inibidores bloqueiam vias de sinalização específicas, promovendo a diferenciação de iPSC em progenitores do neurônio motor.

Adicione enzimas para separar as células.

Colete as células e dissocie-as mecanicamente.

Centrifugue e descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em meios neuronais.

Coloque as células em microlâminas revestidas com proteínas de adesão para promover a adesão celular.

Os fatores de crescimento no meio induzem a maturação do progenitor em neurônios motores.

Para a diferenciação dos neurônios motores, dissocie as culturas de células transfectadas de forma estável com o reagente de dissociação, conforme demonstrado para permitir que as células sejam coletadas em um tubo de 15 mililitros contendo 5 volumes de meio DMEM / F12. Após a centrifugação, ressuspenda as células em meio iPSC humano suplementado com inibidor de ROCK micromolar para contagem.

Semeie as células em placas revestidas com matriz em uma densidade quadrada de 6,25 x 10⁴ células por centímetro. Nos dois dias seguintes, substituir os sobrenadantes por um novo meio de diferenciação suplementado com doxiciclina.

No segundo dia, mude o meio para meio Neurobasal B27 suplementado com inibidor da gama-secretase, inibidor do receptor do fator de crescimento endotelial vascular e doxiciclina. No quinto dia, dissocie as células conforme demonstrado e ressuspenda as células destacadas em 4 mililitros de meio DMEM / F12 para contagem.

A pipetagem é importante para uma dissociação completa das células.

Congelar uma alíquota dos progenitores dos neurónios motores em meio de congelação celular, de acordo com as instruções do fabricante, e recolher o resto das células por centrifugação. Ressuspenda o pellet em meio neuronal suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolar.

Semeie as células em suportes de microlâminas revestidos com laminina de poliornitina com lamínulas de polímero a uma densidade quadrada de 1 x 10⁵ células por centímetro. No sexto dia, substitua cuidadosamente o meio por meio neuronal fresco sem inibidor para cultura até a análise a jusante sem separar as células da superfície de suporte.