Gerando junções neuromusculares usando um dispositivo microfluídico

Comece com um dispositivo microfluídico revestido de polímero com poços interconectados carregando compartimentos espelhados que são conectados por meio de microranhuras.

Semeie células progenitoras neurais nos poços de um compartimento.

Permita que eles migrem para o canal interconectado e adiram ao polímero.

Sobreponha com um meio de crescimento para promover a maturação neuronal em neurônios motores.

No compartimento oposto, semeie os poços com células progenitoras musculares, que migram e aderem ao canal interconectado.

Substitua o meio por um meio de diferenciação, induzindo a fusão das células progenitoras musculares e formando células musculares multinucleadas.

Adicione o meio de diferenciação de neurônios contendo fatores de crescimento ao compartimento contendo células musculares.

Enquanto isso, adicione meio volume de meio livre de fator de crescimento ao compartimento que contém células neurais.

Os fatores de crescimento e um maior volume de meio no compartimento oposto promovem os neurônios motores a estender seus processos através dos microsulcos.

Esses processos neuronais então se conectam com as células musculares, formando junções neuromusculares.

Para plaquear as células progenitoras neurais, ou NPCs, no dispositivo microfluídico, remova o DPBS de dois poços em um lado das microranhuras no dispositivo usando uma pipeta de 200 microlitros. Para semear um total de 250.000 NPCs em 60 a 100 microlitros de meio neurônio motor do dia 10 por dispositivo no poço superior direito, semeie metade da suspensão celular perto da abertura do canal em um ângulo de 45 graus.

Faça uma pausa de alguns segundos para permitir que a suspensão celular flua através do canal antes de adicionar a metade restante da suspensão celular no poço inferior. Use uma caneta para marcar o lado semeado como NPC ou equivalente para facilitar a orientação do dispositivo sem um microscópio e incube por cinco minutos para fixação da célula. Em seguida, complete lentamente os dois poços semeados por NPC com um meio adicional de neurônios motores de dia 10 para um volume total de 200 microlitros por poço. Usando uma pipeta de 200 microlitros, remova o DPBS dos dois poços do outro lado das microranhuras opostas aos NPCs recém-semeados.

Adicione 200 microlitros de meio de neurônio motor do dia 10 por poço aos poços não semeados. Em seguida, adicione 6 mililitros de DPBS por prato de 10 centímetros ao redor do dispositivo para evitar a evaporação do meio durante a incubação.

Para alterar o meio, remova lentamente o meio em ambos os poços com NPCs, posicionando a ponta da pipeta de 200 microlitros na borda inferior da parede do poço, oposta à abertura do canal. Para evitar que um forte fluxo de meio danifique as células no canal, lentamente, adicione 50 a 100 microlitros de meio de neurônio motor fresco a cada poço, alternando continuamente entre o poço superior e inferior. Repita o processo até que cada poço contenha 200 microlitros de meio.

No dia 17 da diferenciação do neurônio motor, remova o meio do neurônio motor no lado não semeado das microranhuras no dispositivo com uma pipeta de 200 microlitros e lave os poços com DPBS. Semeie um total de 200.000 mesoangioblastos primários humanos ou MABs em 60 a 100 microlitros de meio de crescimento por dispositivo, semeando metade da suspensão celular no poço superior.

Faça uma pausa de alguns segundos para permitir que a suspensão celular flua através do canal antes de semear a metade restante da suspensão celular no poço inferior, conforme demonstrado anteriormente para NPCs de revestimento. Incube o dispositivo por cinco minutos para fixação da célula. Em seguida, complete os dois poços recém-semeados com MAB com um meio de crescimento adicional e incube novamente conforme demonstrado.

Para iniciar o gradiente quimiotático e volumétrico no 21º dia da diferenciação do neurônio motor, adicione 200 microlitros por poço de meio basal do neurônio motor contendo fatores de crescimento ao compartimento do miotubo. Em seguida, adicione 100 microlitros por poço de meio basal do neurônio motor sem fatores de crescimento ao compartimento do neurônio motor.