Visualização e mapeamento de vias neuronais em uma fatia de cérebro de amígdala

No cérebro do camundongo, a amígdala contém neurônios que formam conexões sinápticas com o córtex pré-frontal medial, ou neurônios mPFC.

Pegue uma fatia de cérebro de amígdala na qual os neurônios mPFC expressam um canal sensível à luz de rodopsina fundido a uma proteína fluorescente.

Coloque a fatia em uma câmara de gravação e visualize-a sob um microscópio de fluorescência para localizar os neurônios do mPFC.

Mude para uma visão de campo claro e introduza uma pipeta de remendo contendo uma solução interna.

Aplique pressão positiva para avançar a pipeta em direção a um neurônio da amígdala.

Após o contato neuronal, uma covinha se forma.

Aplique sucção para formar uma vedação hermética.

Continue a sucção para romper a membrana, estabelecendo contato com o interior da célula.

Ilumine a fatia para ativar a canalizrodopsina neuronal do mPFC, desencadeando o influxo de íons positivos, a geração de potencial de ação e a liberação de neurotransmissores.

Os neurotransmissores se ligam aos receptores de neurônios da amígdala pós-sináptica, causando influxo de íons e geração de corrente.

Registre a corrente neuronal pós-sináptica para analisar a conectividade mPFC-amígdala.

Para preparar o microscópio patch para ativação optogenética de fibras e células, centralize o diodo emissor de luz montado, ou LED, na via de entrega de luz. Use um medidor de potência para medir a intensidade da luz LED no plano focal traseiro e na saída de cada objetiva em um comprimento de onda de 470 nanômetros. Use uma planilha para calcular a intensidade da luz em miliwatts por milímetro ao quadrado e crie uma curva de calibração para cada objetiva.

Em seguida, recupere uma fatia aguda da amígdala da câmara de interface e coloque-a na câmara de fatia montada no microscópio. Posicione a fatia de forma que a superfície da fatia voltada para cima na câmara de interface também fique voltada para cima na câmara de gravação. Perfunda a fatia com ACSF fresco e oxigenado a uma taxa de 1 a 2 mililitros por minuto. A temperatura deve ser de aproximadamente 31 graus Celsius. Ligue a lâmpada fluorescente e selecione os conjuntos de filtros apropriados para a proteína fluorescente específica expressa. Use o objetivo 5x para obter uma visão geral.

Em seguida, abra ou restrinja a abertura no caminho da luz do microscópio, conforme necessário para o experimento. Para obter um registro de patch, encha uma pipeta de patch com solução interna e monte-a no suporte do eletrodo. Aplique pressão positiva na pipeta de remendo e abaixe-a lentamente na solução do banho. Em seguida, sob controle visual, use o micromanipulador para abaixar a pipeta de adesivo na fatia. Aproxime-se do neurônio de interesse com a pipeta de adesivo pela lateral e por cima.

Libere a pressão positiva quando a pipeta atingir a superfície da célula, conforme indicado por uma covinha visível na superfície da célula. Aplique pressão negativa para obter um gigaseal. Aplique mais sucção para romper o adesivo de membrana e obter o registro de toda a célula. Em seguida, estimule as fibras marcadas com o LED conectado ativando a canalrodopsina com luz de comprimento de onda de 470 nanômetros enquanto registra as respostas elétricas da célula.

Para estimulação sináptica, use as saídas digitais do software de aquisição de dados para acionar o LED. Ajuste a intensidade de estimulação do LED manualmente. Repetir a estimulação com uma abertura aberta ou restrita, conforme necessário para a célula seguinte, ou na presença de substâncias de ensaio específicas.