Coloração por imunofluorescência para visualização de células-tronco neurais proliferadas em seções cerebrais de camundongos

Pegue seções fixas do cérebro de camundongos contendo células neurais, incluindo células-tronco neurais proliferadas marcadas com EdU, um análogo da timidina.

Contorne as seções com uma marcação hidrofóbica para evitar a propagação da solução.

Adicione um detergente para permeabilizar o tecido. Lave para remover o excesso de detergente.

Adicione um fluoróforo para rotular o EdU. Remova o excesso de fluoróforos.

Usando um microscópio de fluorescência, confirme a coloração adequada das células marcadas com EdU.

Aplique um tampão de bloqueio contendo proteínas para evitar a ligação de anticorpos não específicos. Remova o excesso de proteínas.

Incubar com anticorpos primários que se ligam a proteínas específicas em células-tronco neurais. Remova os anticorpos não ligados.

Adicione anticorpos secundários conjugados com fluoróforo para ligar os anticorpos primários. Lave os anticorpos não ligados.

Manchar os núcleos com um corante e remover o excesso de corante.

Remova a marcação hidrofóbica, aplique a mídia de montagem e coloque uma lamínula.

Usando um microscópio confocal, observe as seções para visualizar as células-tronco neurais marcadas.

Para manchar as seções de tecido com análogo de timidina, remova as seções de tecido do tampão citrato. Deixe as seções de tecido secarem e aderirem completamente às lâminas antes de desenhar uma borda com uma caneta hidrofóbica. Em seguida, permeabilize os cortes com tampão de permeabilização por 20 a 30 minutos. Lave as seções duas vezes usando TBS Triton por 5 minutos de cada vez. Em seguida, prepare uma solução de reação EdU.

Incubar as secções em solução de reacção EdU durante 30 minutos a uma hora. Em seguida, lave-os três vezes em TBS Triton por 5 minutos de cada vez. Nesta fase, verifique se a reação EdU funciona usando um microscópio fluorescente. As células marcadas com EdU devem ser observadas se a reação funcionar. Agora, bloqueie as seções de tecido montadas usando tampão de bloqueio criado no mesmo animal que o anticorpo secundário por 30 minutos a uma hora. Em seguida, lave-os duas vezes em TBS Triton por 5 minutos de cada vez.

Durante a etapa de bloqueio, prepare a solução de anticorpo primário misturando o anticorpo primário no tampão de bloqueio. Em seguida, adicione 250 microlitros de solução de anticorpo primário por lâmina para garantir que as seções de tecido estejam completamente submersas e incube-as durante a noite em temperatura ambiente. No dia seguinte, lave as seções de tecido três vezes em TBS Triton por 5 minutos cada para remover o excesso de anticorpo primário.

Em seguida, incubar as secções de tecido em anticorpo secundário conjugado com fluoróforo preparado em solução tampão de bloqueio durante duas horas à temperatura ambiente. Lave as seções de tecido três vezes em TBS Triton por 5 minutos cada para remover o excesso de anticorpos secundários. Em seguida, aplique a solução DAPI 300 micromolar a 1 a 100 em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave as seções de tecido três vezes em PBS por cinco minutos cada para remover o excesso de DAPI e remova o círculo da caneta PAP ao redor do tecido usando um cotonete. Deixe as seções secarem antes de aplicar a mídia de montagem e cobri-las com lamínulas.