Imagem de lapso de tempo da divisão de células-tronco neurais de camundongo usando microscopia confocal

Pegue uma placa de vários poços contendo células-tronco neurais aderidas ou NSCs isoladas de um cérebro de camundongo transgênico. Esses NSCs contêm uma proteína marcada com fluorescência que é específica para a primeira fase de crescimento, ou G1.

À medida que o NSC se divide, ele fluoresce na fase G1 do ciclo celular, enquanto não emite fluorescência em outras fases.

Coloque a placa em uma câmara confocal de varredura a laser para imagens de microscópio, mantida a uma temperatura controlada.

Selecione a lente objetiva desejada e ajuste a intensidade de fluorescência.

Configure os parâmetros para imagens de lapso de tempo.

Escolha a opção de imagem grande e agende a aquisição de imagens em intervalos regulares para a duração desejada.

Use um scanner ressonante de alta velocidade para evitar fotobranqueamento e manter alta resolução.

Use a configuração de campo claro para visualizar a forma da célula e use um filtro fluorescente apropriado para capturar a fluorescência.

Inicie a imagem de lapso de tempo do NSC para visualizar diferentes fases do ciclo celular.

Prepare um microscópio confocal de varredura a laser para imagens pré-aquecendo a câmara de controle de temperatura anexada a 37 graus Celsius sob uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono. Posicione a placa de 96 poços dentro da câmara do microscópio pré-aquecida e coloque o primeiro poço em foco. Em seguida, abra o software de imagem e clique com o botão direito do mouse na janela principal para selecionar Adquirir Controles de Aquisição e Desaquisição para abrir o TI Pad e selecionar o plano Apo VC 20x DIC objetivo.

Em seguida, clique em Adquirir controles de aquisição e abra as opções de lapso de tempo. Defina o centro de cada poço como uma posição de palco e selecione a opção Imagem grande para 7 por 7 milímetros quadrados. Observe uma imagem em mosaico ao redor do centro de cada poço. Defina a sobreposição da imagem grande do mosaico para 5% e defina a frequência para que as fotos sejam tiradas a cada 20 minutos por 24 horas.

Em A1 mais configurações, selecione o nível de tensão do tubo fotomultiplicador para cada fluorescência listada na barra de menus. Selecione para adquirir imagens usando um scanner ressonante de alta velocidade em um formato de 512 por 512 pixels e use o DIC para visualizar as células. Em seguida, selecione a pasta para salvar os arquivos de dados. Selecione o botão Executar agora na janela de aquisição ND para iniciar a aquisição.