Pós-incorporação de Etiquetagem immunogold de proteínas sinápticas em culturas de hipocampo
3 de abril de 2013
A localização e distribuição das proteínas fornecem informações importantes para a compreensão de suas funções celulares. A resolução espacial superior, de microscopia electrónica (ME) pode ser usado para determinar a localização subcelular de um dado antigénio imuno sequência. Para tecidos do sistema nervoso central (SNC), preservando a integridade estrutural durante a antigenicidade manutenção tem sido particularmente difícil em estudos de EM. Aqui, adoptar um procedimento que tem sido utilizada para preservar as estru
O objetivo geral deste procedimento é realizar a marcação ImmunoGold para determinar a localização ultraestrutural de proteínas sinápticas em neurônios parametálicos CA um do hipocampo de ratos. Isso é feito removendo primeiro a região CA uma da fatia organotípica, aparando o canto superior para lembrar a orientação correta e incubando-a em um fixador livre de ósmio no gelo. O segundo passo é desidratar o tecido fixado e deixá-lo endurecer infiltrando-o com resina.
Em seguida, seções ultrafinas são cortadas de tecidos embebidos em resina e colocadas em grades de níquel. A etapa final é realizar imuno-histoquímica nos tecidos de secção. Em última análise, a microscopia imunoeletrônica é usada para determinar a localização de proteínas na sinapse. Okey.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da plasticidade sináptica, como a localização de proteínas dentro das espinhas dendríticas pode ajudar a entender seu papel na função sináptica. Embora esse método seja otimizado para fatias organotípicas do hipocampo, ele também pode ser tremendamente valioso para outras preparações neuronais, incluindo fatias cerebrais agudas e culturas neuronais primárias. Comece este procedimento colocando a fatia organotípica do hipocampo em uma placa de Petri de poliestireno contendo tampão de fosfato de sorensen fresco e gelado.
Adicione mais um a dois mililitros de tampão gelado diretamente em cima das fatias. Para isolar o subcampo da fatia do CA um, use um bisturi descartável para cortar suavemente o corte próximo ao giro denteado, que é paralelo à camada de células CA um. Em seguida, corte a fatia restante verticalmente para remover o subcampo CA três e o sulu.
Em seguida, corte um canto da CA uma fatia para ajudar a identificar a superfície superior do tecido e remova cuidadosamente o tecido da membrana usando a parte de trás do bisturi. Transfira suavemente o tecido para uma placa de 12 poços contendo tampão de sorensen gelado. Remover o tampão e adicionar 0,5 a um mililitro de fixador gelado a pH 7,3 diluído em tampão de Sorensen para que cubra adequadamente a amostra.
Em seguida, incube por duas horas a quatro graus Celsius. Após a incubação, remova o fixador do poço e lave as amostras três vezes por 20 minutos em tampão de sorensen gelado. Em seguida, incube a amostra em 1% de ácido tânico por volume em tampão malato molar 0,1 a um pH de 6,0.
Após 40 minutos, enxágue o ácido tânico lavando a amostra duas vezes por 20 minutos no tampão malato. Em seguida, incube a amostra por 40 minutos em acetato de mictório a 1% em tampão malato O acetato de mictório é sensível à luz e é radioativo. Portanto, manuseie com cuidado e coloque a amostra no escuro a quatro graus Celsius durante a incubação.
Após a incubação, enxágue as amostras duas vezes por 20 minutos cada em tampão malato gelado e, em seguida, incube por 20 minutos em cloreto de platina a 0,5% em tampão de preso. Por fim, enxágue qualquer cloreto de platina residual lavando duas vezes por 20 minutos. Cada buffer de detento armazena as amostras em tampão malato a quatro graus Celsius até que estejam prontas para processamento posterior.
Para iniciar a imuno-histoquímica, as regiões fixas do CA um são primeiro incorporadas em resina desidratada e cortadas para obter seções ultrafinas de 60 nanômetros em grades de níquel, conforme descrito no protocolo de texto para este vídeo. Em seguida, coloque uma gota de tampão fosfato 1% tween 20 em pH 7,5 em um pedaço de paraforma limpa. Em seguida, pegue suavemente a grade com uma pinça limpa e flutue-a no tampão com a seção para baixo incube assim por 10 minutos em temperatura ambiente após a incubação, drene o excesso de líquido da grade colocando o lado da seção para cima em papel de filtro.
Além disso, remova qualquer solução presa entre os braços da pinça EM, absorvendo suavemente com uma lasca de papel de filtro, garantindo que as seções não sequem completamente. Em seguida, coloque uma gota de glicina 50 milimolar no filme para e flutue a seção da grade voltada para baixo na solução de glicina à temperatura ambiente. Enquanto a amostra incuba por 15 minutos, adicione 2,5% de soro do animal do anticorpo secundário a uma solução de 2,5% de BSA e coloque uma gota dessa mistura no filme para.
Após a incubação de 15 minutos, secar a grelha com papel de filtro e flutuar sobre a solução de bloqueio durante 30 minutos. À temperatura ambiente, prepare a câmara de incubação colocando lenços umedecidos enrolados ao longo do interior de uma placa de Petri de plástico limpa. Coloque um pedaço de papel limpo no centro da placa de Petri e adicione água filtrada aos lenços umedecidos.
Em seguida, coloque uma gota da solução de anticorpo primário no paraforme e flutue a amostra em temperatura ambiente ou durante a noite A quatro graus Celsius, o tempo e a temperatura ideais de incubação, bem como a concentração de anticorpos, precisam ser determinados experimentalmente. Após a incubação com o anticorpo primário, lave a grelha três vezes durante dois minutos cada com tampão fosfato 1%tween 20. Em seguida, incube com anticorpo secundário usando um a 20 anti-coelho ou anti-US, acoplado a ouro de 10 nanômetros após uma hora.
À temperatura ambiente, lave três vezes por dois minutos cada com tampão fosfato 1% entre 20. Em seguida, fixe a amostra em glutaraldeído a 2% tamponado por cinco minutos. Remova o excesso de aldeído gluar enxaguando três vezes com 1% de interpolação, tampão de fosfato 20 e, em seguida, três vezes com água filtrada, enxaguando por dois minutos de cada vez.
Depois de enxaguado, incube a grelha em acetato de urinol a 2% durante 10 minutos. Durante a incubação, prepare uma câmara livre de CO2 colocando um pedaço de paraforma no centro de uma placa de Petri de vidro. Em seguida, coloque 10 a 15 pastilhas de hidróxido de sódio no prato ao redor da paraforma para absorver o CO2 no ar.
Mantenha a parte superior fechada por alguns minutos. Em seguida, use uma pipeta de pastagem e transfira rapidamente um pequeno volume de solução de citrato de chumbo Reynolds recém-preparada para a paraforma. Abra a parte superior apenas o suficiente para inserir a pipeta de pastagem para minimizar a reintrodução de CO2 na câmara.
Em três copos pequenos, prepare água deionizada quente recém-fervida, lave o acetato do mictório mergulhando a grade no primeiro bico e gire suavemente por 30 segundos. Repita esta etapa nos outros dois béqueres. Depois de enxaguado, abra a parte superior da placa de Petri de vidro apenas o suficiente para colocar a grade na gota da solução de citrato de chumbo Reynolds.
Se possível, use uma máscara ao fazer isso para evitar respirar citrato de chumbo e evitar a formação de um precipitado. Após 10 minutos, abra ligeiramente a parte superior e remova a grade. Lave-o três vezes, mergulhando-o sequencialmente em três copos frescos de água destilada morna.
Em seguida, deixe a grade secar em um pedaço de papel de filtro para cima. A amostra está agora pronta para visualização com o microscópio eletrônico, seções de tecido ultrafinas da região do hipocampo mostradas aqui como uma micrografia eletrônica de transmissão contêm dendritos e espinhas de neurônios parametálicos facilmente distinguíveis. A identificação de sinapses assimétricas entre o terminal axonal designado com um T e as espinhas dendríticas designadas com um S é facilitada pela presença de densidade pós-sináptica e uma membrana plasmática bem definida.
A distribuição de neuro Grandin nas espinhas dendríticas pode ser vista com a ajuda da marcação ImmunoGold EM e é enfatizada nessas imagens TEM pelas setas. A distância radial da neuro grandina do centro da coluna vertebral à membrana plasmática da coluna vertebral pode ser medida como a distância radial normalizada. Uma distância de zero corresponde a uma partícula que se encontra na membrana e um valor de distância de um representa uma partícula no centro da coluna vertebral.
A distância da neuro grandina à coluna dendrítica pode então ser mostrada graficamente. Aqui, sua distribuição como uma distância radial normalizada é mostrada em azul e, em comparação com uma distribuição aleatória mostrada em rosa, este gráfico mostra que o neuro Grandin está localizado próximo à membrana plasmática. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores que estudam o sistema nervoso explorarem a localização e distribuição de proteínas de interação de receptores, transportadores e canais iônicos e muitos outros em diferentes tecidos cerebrais, incluindo córtex, tálamo, bulbo olfatório e cerebelo.
Não se esqueça de que trabalhar com fixadores pode ser extremamente perigoso e as precauções, como usar luvas e jaleco e manusear os fixadores no capuz de filme, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.
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Visão Geral
Este estudo foca-se na localização de proteínas sinápticas em neurônios piramidais do hipocampo CA1 de ratos, utilizando marcação com ImunoGold e microscopia eletrônica. O procedimento tem como objetivo preservar tanto a integridade estrutural quanto a antigenicidade em tecidos do sistema nervoso central.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imunohistoquímica
Antecedentes
- Compreender a localização proteica é essencial para elucidar as funções celulares.
- A microscopia eletrônica oferece resolução espacial superior para o estudo de estruturas subcelulares.
- A preservação da antigenicidade em tecidos do SNC durante estudos de ME é desafiadora.
- Este estudo utiliza um procedimento específico para enfrentar esses desafios.
Objetivo do Estudo
- Determinar a localização ultraestrutural de proteínas sinápticas.
- Aprimorar a compreensão das funções sinápticas no hipocampo.
- Aplicar a marcação com ImunoOuro de uma forma nova para tecidos do SNC.
Métodos Utilizados
- Remoção da região CA1 de fatias organotípicas.
- Recorte e incubação do tecido em um fixador livre de ósmio.
- Desidratação e infiltração do tecido fixado com resina.
- Obtenção de cortes ultrafinos e realização de imunohistoquímica.
Resultados Principais
- Preservação bem-sucedida de estruturas e antígenos no SNC.
- A localização de proteínas sinápticas foi efetivamente determinada.
- A imunomicroscopia eletrônica forneceu insights detalhados sobre a arquitetura sináptica.
- A metodologia pode ser aplicada a estudos adicionais sobre a localização de proteínas.
Conclusões
- O procedimento adotado é eficaz para o estudo de proteínas sinápticas no SNC.
- A marcação com ImunoOuro combinada com ME aprimora a compreensão das funções sinápticas.
- Essa abordagem pode facilitar pesquisas futuras em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a localização ultraestrutural precisa de proteínas sinápticas em neurônios do hipocampo, apoiando a validação de alvos na descoberta de fármacos em neurociência. Ao preservar tanto a ultraestrutura quanto a antigenicidade em tecidos do SNC, fornece dados de alta confiabilidade para a redução de riscos mecanicistas de alvos sinápticos. A abordagem auxilia na compreensão da distribuição proteica dentro das espinhas dendríticas, orientando hipóteses sobre a função e plasticidade sinápticas relevantes para indicações neuropsiquiátricas e neurodegenerativas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a determinação da localização subcelular precisa de proteínas sinápticas.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica por meio da visualização direta da distribuição de antígenos em espinhas dendríticas e sinapses.
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao associar a localização proteica à arquitetura e função sináptica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem baseada em anticorpos e estudos de engajamento de alvos posteriores.
- Valor Científico: Permite a padronização de ensaios por meio da preservação ultraestrutural reprodutível e distribuição quantitativa de partículas de ouro.
- Valor Científico: Apoia a reutilização da plataforma em preparações neuronais, incluindo fatias agudas e culturas primárias.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a fidelidade do sistema relevante para a doença ao preservar a circuitria trissináptica em fatias hipocampais organotípicas.
- Valor Científico: Facilita o alinhamento translacional de biomarcadores ao permitir a correlação da localização proteica com fenótipos sinápticos.
- Valor Científico: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco mediante a validação ultraestrutural do engajamento do alvo em tecido do SNC.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a hipótese do alvo até a validação pré-clínica, permitindo o refinamento iterativo de alvos proteicos sinápticos com base em dados ultraestruturais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao resolver a localização proteica dentro de compartimentos dendríticos.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de preparação padronizada de tecidos e leituras quantitativas por imunomarcação com ouro.
- Análises: Fornece medidas quantitativas, como distância radial normalizada, para comparar a distribuição de proteínas entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à continuidade pré-clínica por meio da preservação da circuitria hipocampal e da ultraestrutura sináptica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para validação de alvos no sistema nervoso central em diversos modelos neuronais e classes de proteínas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na função de proteínas sinápticas.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de fixação livre de ósmio e marcação padronizada com imunogold.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não ao fornecer evidências ultraestruturais de interação com o alvo em tecido do SNC fisiologicamente relevante.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos sinápticos com base em dados validados de localização subcelular.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microscopia eletrônica, imunohistoquímica e neuroanatomia.
- Depende de acesso a ultramicrótomo, infraestrutura para inclusão em resina e microscópio eletrônico de transmissão.
- Necessita padronização entre equipes distintas envolvendo histologia, imageamento e análise de dados.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes preparações neuronais e alvos proteicos.
- Inclui limitações práticas, como baixo rendimento e manipulação especializada de acetato de uranila e citrato de chumbo.
