Name: Pós-incorporação de Etiquetagem immunogold de proteínas sinápticas em culturas de hipocampo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: Aprenda a técnica de marcação ImmunoGold para localizar proteínas sinápticas em neurônios piramidais do hipocampo de ratos. Este método preserva a integridade estrutural e a antigenicidade para microscopia eletrônica.

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Os autores gostariam de agradecer a Matthew Florença para preparação das culturas de hipocampo. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional dos EUA sobre Envelhecimento e Associação de Alzheimer de NZG.

1. Fixação Fixadores são cancerígenas; usar luvas e lidar com os fixadores em uma coifa. Salvo indicação em contrário, todas as incubações são realizadas em gelo e todas as soluções devem ser filtrados antes da utilização. Use microscopia eletrônica de grau de reagentes. Dia 1 <ol><li class="jove_content"> Após condições experimentais (por exemplo, injecção viral, o tratamento medicamentoso), colocar a membrana com organotípicas de fatias do hipocampo de 60 x 15 mm de poliestireno placa de Petri contendo gelada de tampão fosfato 0,1 M (tampão de Sorensen fosfato), pH 7,3. Adicionar 1 - 2 ml de tampão fosfato 0,1 M directamente em cima das fatias para mantê-las frias. </li></ol> Passo crítico: Sempre utilize buffers recém preparados e fixadores. Certifique-se de que o pH do tampão está dentro do intervalo desejado. A incapacidade de fazê-lo pode danificar estruturas celulares. <ol start="2"><li> Para isolar o subcampo CA1 do corte, usar umdescartável bisturi para cortar suavemente através da próxima fatia a DG, em paralelo com a camada de células CA1 (Figura 1). Em seguida, corte a fatia restante verticalmente para remover o subcampo CA3 eo subículo. Cortado um canto da fatia para ajudar a identificar a superfície superior do tecido. </li></ol> NOTA: No caso de nenhum de entrega viral de proteína de interesse é necessária, a fatia de tecido inteiro pode ser fixada após o meio é removido com uma suave lavagem de tampão arrefecido com gelo. Isto é então seguido por corte para fora do CA1. Passo crítico: Acompanhe a parte de cima do tecido para que corte apropriado das grades mais tarde. <ol start="3"><li> Cuidadosamente remover o tecido a partir da membrana usando a parte traseira do bisturi. Usar uma pipeta de Pasteur para transferir cuidadosamente o tecido a uma placa de 12 poços contendo 0,1 M de tampão fosfato. </li><li> Remover o tampão no poço da placa e adicionar 500 &amp; mu, l - 1 ml de fixador gelada (pH 7,3) composta do seguinte: 0,1% de ácido pícrico, paraformaldeído a 1%, e 2,5% de glutaraldeído em tampão de fosfato 0,1 M. Incubar durante 2 horas a 4 ° C. </li></ol> NOTA: ácido pícrico pode ser explosivo quando seco. Mantenha-o molhado com água em um recipiente bem fechado. Armazenar em local seco e bem ventilado. <ol start="5"><li> Remova o fixador do poço e lavar as amostras 3 vezes (20 minutos cada) em tampão de fosfato 0,1 M. </li><li> Incubar durante 40 min em 1% de ácido tânico (w / v) em 0,1 M de tampão de maleato, pH 6,0. </li><li> Lavar duas vezes (20 minutos cada) em tampão de maleato. </li><li> Incubar durante 40 min, em acetato de uranilo a 1% (w / v) em tampão de maleato no escuro. Acetato de uranilo é sensível à luz e é radioactivo. Cobrir a proveta com Parafilm ao dissolver-se e armazenar qualquer tampão não utilizado no escuro a 4 ° C. </li><li> Lavar duas vezes (20 minutos cada) em tampão de maleato. </li><li> Incubar durante 20 min em 0,5% de cloro platinaide (w / v) em tampão de maleato. </li><li> Lavar duas vezes (20 minutos cada) em tampão de maleato. Armazenar as amostras a 4 ° C até estarem prontos para processamento adicional. </li></ol> 2. Desidratação e incorporação Óxido de propileno é cancerígeno. Evite vapores por trabalhar com ele em uma coifa. Use absoluto, etanol puro a 100%, que não contém qualquer traço de água. Diluir esta etanol absoluto para produzir diferentes concentrações de desidratação. Dia 2 <ol><li> Incubar durante 5 min em etanol a 50% e, em seguida, durante 5 min em etanol a 70%. </li><li> Incubar durante 15 min, em recém-preparados a 1% de p-fenilenodiamina (PPD) em etanol a 70%. </li><li> Enxaguar três vezes em etanol a 70%. </li><li> Incubar durante 5 min em etanol a 80% e, em seguida, durante 5 min em etanol a 95%. </li><li> Incubar em etanol 100% duas vezes por 5 minutos de cada. </li><li> Prepare frascos de vidro com tampas de rosca e verifique se eles são limpos e completamente secos. Transferir as fatias de frascos de vidro erotular cada frasco simples e clara. </li><li> Incubar durante 5 min em 1:1 etanol: óxido de propileno. </li><li> Incubar em óxido de propileno a 100% duas vezes por 5 minutos de cada. </li><li> Adicionar resina (Epon) a cada frasco para dar uma mistura 1:1 com o óxido de propileno. Misture delicadamente para 2 horas. Não agite os frascos muito rigor para evitar bolhas que possam interferir com a incorporação. </li><li> Adicionar resina para fazer uma mistura 3:1 de óxido de propileno, e mistura-se durante 2 h. </li><li> Transferir a resina 100% e incubar O / N. </li></ol> Dia 3 <ol start="12"><li> Amostras sanduíche entre as tiras de plástico ACLAR e cura durante 24 horas a 60 ° C. </li></ol> 3. Corte e montagem em Grids Dia 4 <ol><li> Cortar semi-finas (0,5 mm) e as secções coradas com azul de toluidina a 1% + 1% de bórax para determinar a orientação correcta de amostras. </li><li> Corte cortes ultrafinos (60 nm) e montar em grades de níquel, uma seção por grade. </li></ol>4. Imunohistoquímica Todos os amortecedores e água deve ser filtrada antes de usar. Dia 5 <ol><li> Colocar uma gota (~ 50 ul) de tampão de Tween-20/phosphate 1% (T / PB), pH 7,5, em um pedaço de Parafilm limpo sobre uma superfície plana. Gentilmente pegar a grade com fórceps limpas pela extremidade e flutuar sobre o tampão, a secção abaixo, e incubar durante 10 min à TA. </li><li> Drenar o excesso de líquido a partir da rede, colocando-se na secção do lado de papel de filtro e, em seguida, flutuar na glicina 50 mM em T / PB, durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li></ol> Passo crítico: Para evitar o excesso de &quot;carry-over&quot; de soluções a partir de uma gota de solução para o próximo durante as incubações, drenar o excesso de líquido por tocar suavemente a borda da grade em # 1 filtro de papel entre cada mudança de solução. Também remover qualquer solução de presa entre os braços da pinça EM prende a grade por wicking suavemente com um pedaço de papel de filtro entre os braços de pinça enquanto ensutocar os seções não seque completamente. <ol start="3"><li> Seca-se a grelha com papel de filtro e, em seguida, flutuar na solução de bloqueio contendo BSA a 2,5% e 2,5% de soro a partir do animal de que o anticorpo secundário em T / PB, durante 30 min à TA. </li><li> Incubar com o anticorpo primário (em T / PB), à TA ou O / N a 4 ° C. O tempo óptimo e a temperatura de incubação, assim como a concentração do anticorpo, devem ser determinadas experimentalmente. </li><li> Lava-se a grelha de três vezes (2 minutos cada) com T / PB. </li><li> Incubar com o anticorpo secundário (anti-coelho de 01:20 ou anti-rato acoplado a ouro de 10 nm), durante 1 h à TA. </li><li> Lavar três vezes (2 minutos cada) com T / PB. </li><li> Postfix com glutaraldeído a 2% em T / PB, durante 5 min. </li><li> Lavar três vezes (2 minutos cada) com T / PB e, em seguida, três vezes (2 minutos cada) com água filtrada. </li><li> Incubar com acetato de uranilo a 2% em água durante 10 min. </li></ol> Enquanto a grade é a coloração, a preparar uma câmara de CO 2-livre por placinga pedaço de Parafilm no centro de uma placa de Petri de vidro. Em seguida, coloca 4-6 pellets de NaOH no prato em torno do Parafilm para absorver CO 2 no ar. Manter a parte superior fechada por alguns minutos. Usar uma pipeta de Pasteur e rápida transferência de um pequeno volume de solução de citrato de chumbo de Reynold para o Parafilm no prato de Petri de vidro. Abrir a parte superior apenas o suficiente para inserir a pipeta de Pasteur para minimizar a re-introdução de CO 2 para a câmara. NOTA: Para fazer a solução de Reynold citrato de chumbo, ferver 100 ml de água deionizada em um forno de microondas e deixe esfriar em um recipiente hermético. Num balão volumétrico de 50 ml com rolha, misturar 1,33 g de nitrato de chumbo, 1,76 g de citrato de sódio e 30 ml de água fervida, mediante agitação vigorosa durante 1 min. Em seguida, agitar intermitentemente por 30 min. A esta solução turva, adicionar 8 ml de hidróxido de sódio 1 M e, lentamente, inverter o frasco algumas vezes. Solução se tornará claro. Levar a solução para 50 ml com o wa fervidater. Guardar a solução hermeticamente fechado. Se parece precipitado, descartar e fazer um novo. <ol start="11"><li> Em três copos menores preparar quente, água recém-fervida deionizada. Lavar o acetato de uranilo, por imersão a grade no primeiro béquer e agitar suavemente-la em torno de 30 seg. Repita este passo nos outros dois copos. </li><li> Abrir a parte superior da placa de Petri de vidro apenas o suficiente para colocar a grelha sobre a gota de solução de citrato de chumbo de Reynold. Se possível, use uma máscara ao fazer isto para evitar respirar em citrato de chumbo e para evitar a formação de precipitado. Incubar durante 10 min. </li><li> Abrir a parte superior apenas o suficiente para remover a rede. Evite respirar no citrato de chumbo. Lave a rede três vezes por imersão sequencialmente em três copos com água morna, recentemente fervida destilada. Deixe que a grade seco sobre um pedaço de papel de filtro, a secção para cima. A amostra está pronta para o microscópio eletrônico. </li></ol>

<ol><li>Faulk, W. P., Taylor, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunocolloid+method+for+the+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunocolloid method for the electron microscope.</a> Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).</li>
<li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-+and+affinity+probes+for+electron+microscopy%3A+a+review+of+labeling+and+preparation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques.</a> J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).</li>
<li>Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+to+optimize+post-embedding+single+and+double+staining+for+amino+acid+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).</li>
<li>Berryman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tannic+acid+on+antigenicity+and+membrane+contrast+in+ultrastructural+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).</li>
<li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+ultracryotomy+of+CNS+tissue+for+ultrastructural+and+immunogold+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses.</a> J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).</li>
<li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructual+localization+of+lysozyme+in+human+colon+eosinophils+using+the+protein+A-gold+technique%3A+effects+of+processing+on+probe+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution.</a> J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).</li>
<li>Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+osmium-free+method+of+epon+embedment+that+preserves+both+ultrastructure+and+antigenicity+for+post-embedding+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).</li>
<li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> Embo J. 28, 3027-3039 (2009).</li>
<li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li>
<li>Zhong, L., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+targets+calmodulin+and+lowers+the+threshold+for+the+induction+of+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation.</a> PloS one. 7, e41275(2012).</li>
<li>Horisberger, M., Vauthey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+of+colloidal+gold+with+protein.+A+quantitative+study+using+beta-lactoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin.</a> Histochemistry. 80, 13-18 (1984).</li>
<li>Bendayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+potential+and+versatility+of+colloidal+gold+cytochemical+labeling+for+molecular+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology.</a> Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).</li>
<li>Racz, B., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+coflin+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of coflin in dendritic spines.</a> J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).</li>
<li>Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+the+immunogold+technique+in+quantitation+of+a+soluble+protein+in+ultra-thin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).</li>
<li>Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+antigen%2C+one+gold%3F+A+quantitative+analysis+of+immunogold+labeling+of+plasma+membrane+5%27-nucleotidase+in+frozen+thin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections.</a> Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.</li>
<li>Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BImmunologic+analysis+of+families+with+complement+receptor+deficiency%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon.+Rinsho%22%5BJournal%5D)">[Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency].</a> Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).</li>
<li>Kehle, T., Herzog, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+protein-gold+complexes+and+cell+surfaces%3A+a+method+for+precise+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation.</a> Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).</li>
<li>Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JR+%22Electron+Microscopy%22">Electron Microscopy</a>. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).</li>
<li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li>
<li>Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSD-95+is+associated+with+the+postsynaptic+density+and+not+with+the+presynaptic+membrane+at+forebrain+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses.</a> J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).</li>
<li>Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+localization+of+B-50+phosphoprotein%3A+the+%28ACTH%29-sensitive+protein+kinase+substrate+involved+in+rat+brain+polyphosphoinositide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism.</a> Brain Research. 328, 381-385 (1985).</li>
<li>Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+phosphoprotein+B-50%2FGAP-43+in+neuronal+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim.+Pol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity.</a> Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).</li>
<li>Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaunsbach%2C+AA+%22Biomedical+Electron+Microscopy+Illustrated+Methods+and+Interpretations%22">Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations</a>. , Academic Press. 383-426 (1999).</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

Neste protocolo, adotamos o método Phend e Weinberg para o cérebro e nos tecidos da medula espinhal para estudar espinhas dendríticas em culturas de ratos hipocampo fatia. Espinhas dendríticas na área CA3-CA1 do hipocampo são delicadas estruturas que contêm uma grande variedade de proteínas que desempenham papéis importantes na regulação de funções neuronais. O método apresentado fornece uma abordagem equilibrada para alcançar antigenicidade melhorada, mantendo boa preservação ultraestrutural (Figura 2A),</stron...

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de poliestireno de 60 x 15 mm</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi descartável</td><td>EXELINT</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de cultura de células</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>ouro anti-coelho de cabra de 10 nm</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-neurogranina</td><td>Millipore</td><td>AB5620</td><td></td></tr><tr><td>100% </td><td>Microscopia eletrônica</td> de ácido pícrico Ciências <td>19550</td><td></td></tr><tr><td>96% Paraformaldeído</td><td>Acros Organics</td><td>AC41678-0030</td><td></td></tr><tr><td>25% Glutaraldeído (grau EM)</td> <td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranila</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>p-fenilenodiamina</td><td>Sigma</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td> <td>de platina (IV)Sigma</td><td>379840</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia Eletrônica</td><td>de Ácido Tânico</td><td>Ciências 21710</td><td></td></tr></tbody></table>

pós-incorporação de etiquetagem immunogold de proteínas sinápticas em culturas de hipocampo

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Imunomicroscopia é uma ferramenta poderosa para estudar moléculas biológicas em nível subcelular. Anticorpos acoplados a marcadores densos em electrões, tais como ouro coloidal podem revelar a localização e distribuição de antigénios específicos em diversos tecidos 1. As duas técnicas mais utilizadas são as técnicas de incorporação de pré-e pós-incorporação. Na incorporação de pré-imuno-microscopia eletrônica (ME) técnicas, o tecido deve ser permeabilizadas para permitir a penetração de anticorpos antes de ser incorporado. Estas técnicas são ideais para a preservação de estruturas, mas uma fraca penetração do anticorpo (geralmente apenas os primeiros poucos micrómetros) é um inconveniente considerável 2. Os métodos de pós-incorporação de rotulagem pode evitar este problema, porque rotulagem ocorre em seções de tecidos fixos onde os antígenos são mais facilmente acessíveis. Ao longo dos anos, um número de modificações têm melhorado os métodos de incorporação pós-para aumentar a imunorreactividade e para preservar a ultraestrutura <sup&gt; 3-5. Fixação do tecido é uma parte crucial de estudos EM. Fixadores quimicamente ligações cruzadas das macromoléculas para bloquear as estruturas de tecidos no seu lugar. A escolha de fixador afeta não só a preservação, mas também estrutural antigenicidade e contraste. Tetróxido de ósmio (OsO4), formaldeído, glutaraldeído e têm sido os fixadores padrão ao longo de décadas, incluindo para o sistema nervoso central (SNC), os tecidos que são especialmente propensas a danos estruturais durante processamento químico e físico. Infelizmente, OsO 4 é altamente reactivo e tem sido demonstrado que mascaram os antigénios 6, resultando na rotulagem pobre e insuficiente. Abordagens alternativas para evitar a fixação química incluem o congelamento dos tecidos. Mas estas técnicas são de difícil execução e exigem instrumentação dispendiosa. Para resolver alguns desses problemas e para melhorar a rotulagem SNC tecido, Phend et al. substituído OsO 4 com acetato de uranila (UA) e ACI tânicod (TA), e introduzidos com sucesso modificações adicionais para melhorar a sensibilidade da detecção de antigénio e preservação estrutural em tecidos cerebrais e da medula espinal 7. Adotamos este método ósmio livre de pós-incorporação ao tecido cerebral de ratos e otimizou a técnica de rotulagem immunogold para detectar e estudar proteínas sinápticas. Apresentamos aqui um método para determinar a localização ultra-estrutural de proteínas sinápticas em ratos hipocampais CA1 neurônios piramidais. Utilizamos fatias organotípicas de hipocampo cultivadas. Estas fatias de manter o circuito trisynaptic do hipocampo, e, portanto, são especialmente úteis para o estudo da plasticidade sináptica, um mecanismo muito pensou ser a base de aprendizagem e memória. Organotípicas de fatias de hipocampo pós-natais dias 5 e 6 de ratinho / rato pups pode ser preparado como descrito anteriormente 8, e são especialmente úteis para agudamente knockdown ou superexpressam proteínas exógenas. Nós já usou este protocolo para characterize neurogranin (Ng), uma proteína específica para neurónios, com um papel crítico na regulação da função sináptica 8,9. Temos também utilizado para caracterizar a localização ultraestrutural da calmodulina (CaM), e Ca2 + / CaM proteína-quinase dependente de II (CaMKII) 10. Como ilustrado nos resultados, este protocolo permite a preservação ultraestrutural bom das espinhas dendríticas e rotulagem eficiente de Ng para ajudar a caracterizar a sua distribuição na coluna 8. Além disso, o procedimento aqui descrito pode ter uma ampla aplicabilidade no estudo de muitas outras proteínas envolvidas em funções neuronais.

A Figura 2B mostra um exemplo de distribuição de moléculas endógenas Ng nas espinhas dendríticas de CA1 do hipocampo neurónios piramidais. Grelhas de níquel com ultrafinas (60 nm) contendo tecidos CA1 região do hipocampo (como pode ser visto na Figura 2A) foram cobertos em 1% T / PB, 50 mM de glicina, e depois bloqueadas com BSA a 2,5% e 2,5% de soro, antes da incubação com anti Ng-anticorpo. Após a lavagem com T / PB, grelhas foram então cobertas com anticorpo anti-coelho secundário ac...

A localização e distribuição das proteínas fornecem informações importantes para a compreensão de suas funções celulares. A resolução espacial superior, de microscopia electrónica (ME) pode ser usado para determinar a localização subcelular de um dado antigénio imuno sequência. Para tecidos do sistema nervoso central (SNC), preservando a integridade estrutural durante a antigenicidade manutenção tem sido particularmente difícil em estudos de EM. Aqui, adoptar um procedimento que tem sido utilizada para preservar as estruturas e os antigénios do SNC para estudar e caracterizar proteínas sinápticas no hipocampo de ratos neurónios CA1 piramidais.

Pós-incorporação de Etiquetagem immunogold de proteínas sinápticas em culturas de hipocampo

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar a marcação com Imunooro para determinar a localização ultraestrutural de proteínas sinápticas em neurônios parametais do hipocampo CA1 de rato. Isso é realizado primeiramente removendo a região CA1 do corte organotípico, aparando o canto superior para lembrar a orientação correta e incubando-o em um fixador livre de ósmio sobre gelo. O segundo passo é desidratar o tecido fixado e permitir que ele endureça mediante a infiltração com resina.Em seguida, cortes ultrafinos são obtidos de tecidos embutidos em resina e colocados sobre grades de níquel. O passo final consiste em realizar imunohistoquímica nos tecidos em corte. Por fim, utiliza-se a imunomicroscopia eletrônica para determinar a localização de proteínas na sinapse. Ok.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da plasticidade sináptica, como a forma como a localização de proteínas dentro das espinhas dendríticas pode auxiliar na compreensão de seu papel na função sináptica. Embora este método seja otimizado para fatias organotípicas de hipocampo, ele também pode ser extremamente valioso para outros preparos neuronais, incluindo fatias cerebrais agudas e culturas primárias de neurônios. Inicie este procedimento colocando a fatia hipocampal organotípica em uma placa de Petri de poliestireno contendo tampão fosfato de Sorensen fresco e gelado.Adicione um volume adicional de um a dois mililitros de tampão gelado diretamente sobre as fatias. Para isolar o subcampo CA1 da fatia, use um bisturi descartável para cortar suavemente ao lado do giro denteado, paralelamente à camada celular de CA1. Em seguida, corte a fatia restante verticalmente para remover o subcampo CA3 e o sulu.Em seguida, corte um canto do CA em uma fatia para ajudar a identificar a superfície superior do tecido e remova cuidadosamente o tecido da membrana usando a parte traseira do bisturi. Transfira suavemente o tecido para uma placa de 12 poços contendo tampão de Sorensen gelado. Remova o tampão e adicione de 0,5 a um mililitro de fixador gelado, diluído em tampão de Sorensen e ajustado a pH 7,3, de modo que cubra adequadamente a amostra.Em seguida, incubar por duas horas a quatro graus Celsius. Após a incubação, remover o fixador do poço e lavar as amostras três vezes por 20 minutos em tampão Sorensen gelado. Em seguida, incubar a amostra em ácido tânico 1% (peso por volume) em tampão malato 0,1 molar com pH de 6,0.Após 40 minutos, remova o ácido tânico lavando a amostra duas vezes durante 20 minutos no tampão de malato. Em seguida, incube a amostra por 40 minutos em 1% de acetato de uranila no tampão de malato. O acetato de uranila é sensível à luz e é radioativo. Portanto, manipule com cuidado e coloque a amostra no escuro a quatro graus Celsius durante a incubação.Após a incubação, lave as amostras duas vezes, por 20 minutos cada, em tampão de malato gelado, e depois incube por 20 minutos em cloreto de platina 0,5% no tampão inmate. Por fim, remova qualquer resíduo de cloreto de platina lavando duas vezes por 20 minutos. Em cada tampão inmate, armazene as amostras em tampão de malato a quatro graus Celsius até que estejam prontas para processamento adicional.Para iniciar a imunohistoquímica, as regiões do CA1 fixadas são primeiramente desidratadas, embutidas em resina e cortadas para obter seções ultrafinas de 60 nanômetros em grades de níquel, conforme descrito no protocolo textual deste vídeo. Em seguida, coloque uma gota de tampão fosfato com 1% de tween 20 em pH 7,5 sobre um pedaço limpo de paraformaldeído. Então, levante cuidadosamente a grade com pinças limpas e flutue-a sobre o tampão com a seção voltada para baixo, incubando dessa forma por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, remova o excesso de líquido da grade colocando-a com a seção voltada para cima sobre papel filtro.Além disso, remova qualquer solução aprisionada entre as hastes da pinça eletromagnética (EM) por meio de absorção suave com uma tira de papel de filtro, garantindo que os cortes não sequem completamente. Em seguida, coloque uma gota de glicina 50 milimolar sobre o filme de parafina e flutue a grade com o lado do corte voltado para baixo na solução de glicina à temperatura ambiente. Enquanto a amostra incuba por 15 minutos, adicione 2,5% de soro do animal de origem do anticorpo secundário a uma solução de 2,5% de BSA e coloque uma gota dessa mistura sobre o filme de parafina.Após a incubação de 15 minutos, seque a grade com papel filtro e coloque-a sobre a solução bloqueadora por 30 minutos. À temperatura ambiente, prepare a câmara de incubação colocando lenços Kim enrolados ao longo da borda interna de uma placa de Petri plástica limpa. Coloque um pedaço de param limpo no centro da placa de Petri e, em seguida, adicione água filtrada aos lenços Kim.Em seguida, coloque uma gota da solução de anticorpo primário sobre o paraforma e deixe a amostra flutuar sobre ela à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. O tempo e a temperatura ideais de incubação, bem como a concentração do anticorpo, devem ser determinados experimentalmente. Após a incubação com o anticorpo primário, lave a grade três vezes, por dois minutos cada, com tampão fosfato contendo 1% de tween 20. Em seguida, realize a incubação com o anticorpo secundário usando anticorpo anti-coelho ou anti-US, conjugado a ouro de 10 nanômetros, por uma hora.À temperatura ambiente, lave três vezes por dois minutos cada com tampão fosfato 1% tween 20. Em seguida, fixe a amostra com glutaraldeído tamponado a 2% por cinco minutos. Remova o excesso de glutaraldeído lavando três vezes com tampão fosfato 1% tween 20 e, depois, três vezes com água filtrada, por dois minutos cada vez.Após a lavagem, incubar a grade em ácido acético a 2% por 10 minutos. Durante a incubação, preparar uma câmara livre de CO₂ colocando um pedaço de paraform na parte central de uma placa de Petri de vidro. Em seguida, colocar de 10 a 15 comprimidos de hidróxido de sódio no recipiente ao redor do paraform para absorver o CO₂ do ar.Mantenha a tampa fechada por alguns minutos. Em seguida, use uma pipeta Pasteur e transfira rapidamente um pequeno volume da solução fresca de citrato de chumbo de Reynolds para o paraforma. Abra a tampa apenas o suficiente para inserir a pipeta Pasteur, minimizando assim a reintrodução de CO₂ na câmara.Em três béqueres pequenos, prepare água desionizada aquecida e recém-fervida para remover o acetato do urinal mergulhando a grade no primeiro béquer e agitando suavemente por 30 segundos. Repita este passo nos outros dois béqueres. Após a lavagem, abra a tampa do recipiente de vidro de Petri o suficiente para colocar a grade sobre a gota de solução de citrato de chumbo de Reynolds.Se possível, use uma máscara durante este procedimento para evitar respirar citrato de chumbo e prevenir a formação de um precipitado. Após 10 minutos, abra levemente a tampa e remova a grade. Lave-a três vezes mergulhando-a sequencialmente em três béqueres diferentes com água destilada morna.Em seguida, deixe a grade secar sobre um pedaço de papel filtro. A amostra está agora pronta para visualização com o microscópio eletrônico. Cortes ultrafinos de tecido da região do hipocampo mostrada aqui, como um micrografia eletrônica de transmissão, contêm dendritos e espinhos de neurônios parametais facilmente distinguíveis. A identificação de sinapses assimétricas entre terminais axonais designados com um T e espinhos dendríticos designados com um S é facilitada pela presença de densidade pós-sináptica e uma membrana plasmática bem definida.A distribuição de neurograndin nas espinhas dendríticas pode ser observada com a ajuda da marcação imunológica por Imunourânio EM e é destacada nestas imagens de MET pelas setas. A distância radial da neurograndin a partir do centro da espinha até a membrana plasmática da espinha pode ser medida como a distância radial normalizada. Uma distância igual a zero corresponde a uma partícula localizada sobre a membrana, e um valor de distância igual a um representa uma partícula situada no centro da espinha.A distância do neuro grão até o espinho dendrítico pode então ser representada graficamente. Aqui, sua distribuição como uma distância radial normalizada é mostrada em azul e comparada a uma distribuição aleatória mostrada em rosa; este gráfico indica que o neuro grão está localizado próximo à membrana plasmática. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores que estudam o sistema nervoso explorarem a localização e distribuição de receptores, proteínas interativas de receptores, transportadores e canais iônicos, entre outros, em diferentes tecidos cerebrais, incluindo o córtex, tálamo, bulbo olfatório e cerebelo.Não se esqueça de que o trabalho com fixadores pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de luvas e jaleco de laboratório e o manuseio dos fixadores na câmara de fluxo laminar, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o procedimento para colorir fatias fixas de cérebro de rato contendo interneurônios cheios de biocitina. O protocolo inclui incubação com complexo avidina-biotina (ABC), coloração com HRP e substrato cromogênico, preservação de estruturas com tetróxido de ósmio e incorporação do tecido em resina para imagem.

Marcação de interneurônios preenchidos com biocitina em fatias de hipocampo de rato para visualização

Fonte: Schönherr, S., et. al. Imunomarcação Combinada de Réplica Optogenética e de Fratura por Congelamento para Examinar o Arranjo Específico de Entrada de Receptores de Glutamato na Amígdala de Camundongo. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a imunomarcação de réplicas fraturadas por congelamento de tecido cerebral de camundongo para microscopia eletrônica. As réplicas fraturadas e revestidas são digeridas para expor os receptores. Anticorpos primários e secundários marcados com ouro são...

Imunomarcação de proteínas da membrana neuronal em uma amostra fraturada por congelamento de tecido cerebral de camundongo

Fonte: McLeod, F., et al. Avaliação da densidade de sinapses em fatias de cérebro de roedores hipocampais. J. Vis. Exp. (2017). Este vídeo demonstra um método para visualizar marcadores sinápticos em fatias cerebrais do hipocampo usando análise de imunofluorescência confocal. As fatias são imunomarcadas com anticorpos primários direcionados a marcadores pré-sinápticos e pós-sinápticos, seguidos por anticorpos secundários conjugados com fluoróforo. Os marcadores marcados são então visualizados...

Análise microscópica de sinapses em fatias de hipocampo de camundongos usando imunofluorescência

Nós fornecer um protocolo detalhado para a indução de potenciação de longo prazo na região CA1 do hipocampo e o subsequente isolamento de fracções enriquecidas nucleares da área tetanized da fatia. Esta abordagem pode ser utilizada para determinar a actividade da importação nuclear de proteína dependente em modelos celulares de aprendizagem e memória.

Isolamento de CA1 Nucleares frações enriquecidas de fatias do hipocampo para o Estudo de dependentes de Atividade Nuclear Importação de Mensageiro Proteínas Synapto nucleares

Este artigo em vídeo descreve procedimentos experimentais para estudar a plasticidade de longo prazo e seus processos associativos, como marcação sináptica, captura e marcação cruzada nos neurônios piramidais CA1 usando fatias agudas do hipocampo de roedores.

Investigação de Synaptic Tagging / Captura e-captura Cruz usando aguda fatias do hipocampo de roedores

O método de imunoouro pós-incorporação é uma das maneiras mais eficazes de fornecer análises de alta resolução da localização subcelular de moléculas específicas. Aqui descrevemos um protocolo para analisar quantitativamente os receptores de glutamato nas sinapses da fita retiniana.

High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses

Este artigo ilustra como a expressão de receptores de neurotransmissores pode ser quantificada e o padrão analisado em sinapses com elementos pré e pós-sinápticos identificados usando uma combinação de transdução viral de ferramentas optogenéticas e a técnica de imunomarcação de réplica de fratura por congelamento.

Combinado optogenética e Freeze-fratura Replica imunomarcação para examinar Arranjo específicos de entrada de glutamato receptores no mouse Amygdala

Este protocolo apresenta um método para a recuperação morfológica dos neurónios durante patched registos electrofisiolicos utilizando biocitina de enchimento e de pós-processamento subsequente imuno-histoquímica. Mostramos que as seções encheu-biocitina grossas que estavam manchados e lamínulas pode ser restained com um segundo dia de anticorpos primários ou meses mais tarde.

Imunocoramento Secções biocitina-preenchidos e processados ​​para neuroquímicos Markers

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Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

Um protocolo para com precisão, identificando e analisando as sinapses em fatias hippocampal usando a imunofluorescência é descrito neste artigo.

Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

Aprenda a técnica de marcação ImmunoGold para localizar proteínas sinápticas em neurônios piramidais do hipocampo de ratos. Este método preserva a integridade estrutural e a antigenicidade para microscopia eletrônica.

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