Analisando a reciclagem de vesículas sinápticas e a absorção de corantes fluorescentes em larvas de Drosophila

Coloque uma preparação neuromuscular de larvas de Drosophila viva em uma câmara de registro contendo solução salina livre de cálcio.

Os neurônios larvais expressam um canal catiônico sensível à luz.

Mude para solução salina com adição de cálcio contendo um corante fluorescente.

O corante fluoresce fracamente no estado não internalizado, mas fortemente quando internalizado pelos neurônios.

Ilumine a larva com luz azul.

Isso ativa o canal, induzindo o influxo de cátions e a despolarização dos neurônios, iniciando um potencial de ação.

O potencial de ação atinge o terminal sináptico na junção neuromuscular, permitindo o influxo de cálcio e a exocitose da vesícula.

Posteriormente, a membrana ligada ao corante é internalizada durante a reciclagem da vesícula.

Lave com solução salina sem cálcio para impedir a reciclagem das vesículas e remover qualquer corante não internalizado.

Visualize o sinal de fluorescência.

Em seguida, introduza solução salina sem adição de cálcio sem corante e ilumine novamente.

Isso induz outro potencial de ação, influxo de cálcio e exocitose de vesículas contendo corante.

Visualize o sinal novamente.

A liberação do corante devido à exocitose da vesícula reduz a fluorescência em comparação com o estado durante a internalização da vesícula.

Para estimulação de canalrodopsina, conecte um LED azul a um estimulador programável usando um cabo coaxial e coloque o LED na porta da câmera. Focalize o feixe de luz LED azul na preparação com corante FM usando a função Zoom do microscópio.

A etapa mais crítica neste ponto do procedimento é garantir que as configurações do LED sejam mantidas constantes e que você ilumine a mesma parte de cada animal para todas as condições que estão sendo comparadas para garantir uma força de estimulação consistente.

Inicie a estimulação de luz e acompanhe com o temporizador pela duração predeterminada do período de estimulação optogenética. Quando o cronômetro parar, remova rapidamente a solução de corante FM e substitua-a por solução salina sem cálcio para interromper o ciclo SV. Para descarga de corante FM, inicie a estimulação de luz e acompanhe com o temporizador pela duração predeterminada do período de estimulação optogenética. Quando o período do temporizador terminar, remova rapidamente a solução de corante FM e substitua-a por solução salina sem cálcio para interromper o ciclo do SV.