Qual é a importância de medir o potencial de membrana em células endoteliais?

Medir o potencial de membrana ajuda a entender o estado funcional e as vias de sinalização das células endoteliais.

Como funciona o corante sensível ao cálcio?

O corante se liga aos íons de cálcio, e sua intensidade de fluorescência aumenta com maiores concentrações de cálcio, permitindo a quantificação dos níveis de cálcio intracelular.

Quais são as implicações de um potencial de membrana alterado?

Um potencial de membrana alterado pode indicar mudanças na atividade celular, como ativação de canais iônicos ou engajamento de vias de sinalização.

Este método pode ser aplicado a outros tipos de células?

Sim, a metodologia pode ser adaptada para uso com outros tipos de células para estudar seu potencial de membrana e sinalização de cálcio.

Que papel os agentes farmacológicos desempenham neste estudo?

Agentes farmacológicos são usados para manipular vias de sinalização e avaliar seus efeitos nos níveis de cálcio e potencial de membrana.

Esta técnica é adequada para imagens de células vivas?

Sim, a técnica foi projetada para imagens de células vivas, permitindo a observação em tempo real da dinâmica celular.

Análise da dinâmica do cálcio e alterações do potencial de membrana em um endotélio arteriolar de camundongo

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

0 views • 2:38 min • April 28th, 2025

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Prenda um tubo endotelial arteriolar colhido de um cérebro de camundongo em uma câmara com um fluxo tampão contínuo.

Coloque a câmara em uma configuração de gravação.

Introduza um corante fluorescente sensível ao cálcio. Incubar para permitir a absorção celular do corante.

Lave para remover qualquer corante não internalizado.

Insira um eletrodo em uma célula endotelial e registre o potencial de membrana em repouso.

Aumente a temperatura do banho para uma temperatura fisiológica para facilitar a ligação do cálcio intracelular ao corante.

Excite o corante e meça a fluorescência para quantificar os níveis basais de cálcio celular.

Introduza um medicamento que se liga a receptores específicos acoplados à proteína G nas células endoteliais, iniciando uma cascata de sinalização.

Essa cascata libera íons de cálcio do retículo endoplasmático para o citoplasma, aumentando a ligação e a fluorescência do corante de cálcio.

Níveis elevados de cálcio citoplasmático também ativam os canais de potássio, facilitando o efluxo de íons potássio e diminuindo o potencial de membrana.

Registre os dados.

O aumento da fluorescência e a diminuição do potencial de membrana indicam um tubo endotelial funcional.

Para medir o potencial da membrana endotelial, enquanto visualiza através do objetivo de quatro vezes, posicione cuidadosamente a ponta afiada do eletrodo logo acima de uma célula do tubo endotelial arterial na solução salina fisiológica que flui com um micromanipulador. Gradualmente, aumente a ampliação para 400 vezes e reposicione a ponta do eletrodo conforme necessário. Usando o micromanipulador, insira suavemente a ponta de um eletrodo afiado em uma das células do tubo endotelial e comece a registrar a VM usando um eletrômetro.

Uma vez que o VM endotelial em repouso esteja estável de menos 30 a menos 40 milivolts, aplique os agentes farmacológicos desejados por objetivo experimental. Carregue o tubo endotelial com o rastreador de fluorescência para a membrana plasmática ou organela desejada a 37 graus Celsius por 15 a 30 minutos. Lave as células com solução salina fisiológica de superfusão fresca e obtenha imagens de células vivas ao microscópio no comprimento de onda de excitação dos respectivos corantes.