Imagem do tráfego de proteínas GLUT4 em neurônios hipotalâmicos primários de camundongos usando microscopia de deconvolução

Comece com neurônios hipotalâmicos primários de camundongos do tipo selvagem e knockout para CCR5 cultivados em lamínulas revestidas com poli-D-lisina em uma placa de vários poços.

Esses neurônios expressam o transportador de glicose 4 marcado com proteína fluorescente verde (GFP-GLUT4) no citoplasma.

Transfira as lamínulas para lâminas de vidro e limpe suavemente o excesso de mídia para garantir a estabilidade durante a aquisição da imagem.

Coloque uma lâmina no estágio do microscópio de deconvolução com a lamínula voltada para baixo.

Visualize os neurônios sob iluminação de campo claro e, em seguida, trate-os com a quimiocina CCL5 e insulina sequencialmente.

Mude para iluminação de fluorescência para identificar neurônios-alvo que expressam GFP-GLUT4 e ajustar os parâmetros de imagem para capturar imagens fluorescentes ao vivo.

Em neurônios do tipo selvagem, a insulina e o CCL5 se ligam ao receptor de insulina e ao CCR5, respectivamente, ativando as vias de sinalização a jusante que impulsionam a translocação da membrana GFP-GLUT4.

Nos neurônios knockout para CCR5, o CCL5 não consegue se ligar, resultando em translocação GFP-GLUT4 reduzida.

Capture as imagens e aplique um algoritmo de deconvolução para reduzir a luz fora de foco, melhorando a clareza e a resolução da imagem.

Para preparar as células para imagens ao vivo, remova cuidadosamente as lamínulas com neurônios usando uma pinça e coloque-as na lâmina de vidro com cuidado. Em seguida, remova o excesso de meio com lenços delicados, dobrando-os duas vezes e colocando-os cuidadosamente na lamínula sem movê-la.

É essencial remover o excesso de meio para evitar movimentos desnecessários na lamínula.

Em seguida, trate as amostras de células selecionadas com CCL5 a 10 nanogramas por mililitro ou insulina a 10 unidades por mililitro por um minuto. Em seguida, adicione 1,5 microlitros de insulina diluída na borda das lamínulas. Em seguida, adicione óleo de imersão em uma lente objetiva de 60 vezes com ampliação de 1,52 NA.

Em seguida, coloque as lamínulas no microscópio de deconvolução stage com as lamínulas voltadas para baixo e presas adequadamente. Use iluminação de campo claro ou fluorescência para identificar as células-alvo. Depois, ajuste o foco até que as células-alvo possam ser claramente observadas. Não mova a lente objetiva para fora da área da lamínula para evitar arranhões desnecessários.

Em seguida, identifique GFP-GLUT4 pelo sinal GFP. Em seguida, identifique as células-alvo desejadas para aquisição de imagens. Em seguida, defina os parâmetros experimentais adequados em cada célula-alvo, incluindo número de pixels, comprimento de onda de excitação, porcentagem de transmissão, tempo de exposição, espessura da pilha, intervalo de tempo e tempo total de imagem. Ajuste o parâmetro de exposição para aproximadamente 2.000 a 3.000 contagens para obter a intensidade máxima de pixels.

Para minimizar o fotobranqueamento por fluorescência, reduza ao máximo a porcentagem de transmissão da luz de excitação, mantendo o tempo de exposição inferior a 1 segundo. Defina o limite superior e inferior da pilha z em cada célula-alvo movendo a platina do microscópio até que a parte superior e inferior da célula-alvo estejam ligeiramente fora de foco.