Imagem do tráfego de proteínas GLUT4 em neurônios hipotalâmicos primários de camundongos usando microscopia de deconvolução

Comece com neurônios hipotalâmicos primários de camundongos do tipo selvagem e knockout para CCR5 cultivados em lamínulas revestidas com poli-D-lisina em uma placa de vários poços.

Esses neurônios expressam o transportador de glicose 4 marcado com proteína fluorescente verde (GFP-GLUT4) no citoplasma.

Transfira as lamínulas para lâminas de vidro e limpe suavemente o excesso de mídia para garantir a estabilidade durante a aquisição da imagem.

Coloque uma lâmina no estágio do microscópio de deconvolução com a lamínula voltada para baixo.

Visualize os neurônios sob iluminação de campo claro e, em seguida, trate-os com a quimiocina CCL5 e insulina sequencialmente.

Mude para iluminação de fluorescência para identificar neurônios-alvo que expressam GFP-GLUT4 e ajustar os parâmetros de imagem para capturar imagens fluorescentes ao vivo.

Em neurônios do tipo selvagem, a insulina e o CCL5 se ligam ao receptor de insulina e ao CCR5, respectivamente, ativando as vias de sinalização a jusante que impulsionam a translocação da membrana GFP-GLUT4.

Nos neurônios knockout para CCR5, o CCL5 não consegue se ligar, resultando em translocação GFP-GLUT4 reduzida.

Capture as imagens e aplique um algoritmo de d