Visualizando a atividade da proteína quinase A em um camundongo usando microscopia de imagem de fluorescência de dois fótons

Prenda um camundongo anestesiado com uma janela craniana sobre seu córtex motor em uma esteira.

O camundongo expressa um repórter de proteína quinase-A em neurônios corticais.

Posicione a esteira sob uma objetiva FLIM de dois fótons.

Adicione uma gota de água entre a objetiva e a janela craniana.

Deixe o mouse acordar e se acostumar com a esteira.

Usando iluminação de campo claro, localize a região de imagem. Feche o invólucro do microscópio para bloquear a luz externa.

Defina os parâmetros de imagem, inicie a rotação da esteira para induzir a locomoção e comece a obter imagens.

A locomoção forçada ativa o PKA, que fosforila o repórter, aproximando seus fluoróforos doadores e aceptores.

O microscópio direciona um laser infravermelho, estimulando o doador a transferir energia para o receptor, reduzindo a vida útil da fluorescência do doador. Quando a

locomoção para, o PKA e o repórter retornam aos seus estados inativos, diminuindo a transferência de energia e aumentando a vida útil da fluorescência do doador.

Analise as imagens para comparar os níveis corticais de PKA durante o repouso e a locomoção.

Pelo menos duas semanas após a instalação da janela craniana, defina o comprimento de onda do laser de excitação de dois fótons para 960 nanômetros e confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé no camundongo experimental anestesiado. Coloque o mouse anestesiado na esteira motorizada e monte a placa de cabeça do mouse no suporte da placa de cabeça da configuração da esteira. Limpe a superfície da lamínula da janela craniana com etanol 70% e coloque a esteira motorizada sob a objetiva 2pFLIM.

Aplique uma gota de água destilada entre a lamínula da janela craniana na objetiva e permita que o mouse acorde e se acostume ao ambiente da esteira e do microscópio por pelo menos 10 minutos. Navegue até o local da injeção sob epi-iluminação e documente as características fiduciais sob campo claro para auxiliar na imagem da mesma região de interesse durante as sessões de imagem subsequentes.

Desligue a fonte de luz de epi-iluminação. Inclua o invólucro do equipamento de microscópio 2pFLIM. Para ativar os tubos fotomultiplicadores do microscópio 2pFLIM, ligue o comando de hardware voltage controle. Para adquirir uma imagem Z-stack 2pFLIM, defina o tamanho da imagem como 128 por 128 pixels. A velocidade de varredura é de 2 milissegundos por linha, o campo de visão é de 90 a 100 micrômetros no quadro, com média de três quadros.

Ajuste as configurações de imagem com base na preparação e na configuração de hardware. E inspecione a imagem adquirida na visualização FLIM. Use um campo de visão reduzido, velocidade de varredura reduzida, maior potência do laser e maior número de quadros a serem calculados para aumentar a contagem de fótons integrados e reduzir o erro de estimativa de vida útil conforme necessário.

Certifique-se de obter fótons suficientes por região de interesse. Uma contagem de fotos integrada viável para um soma positivo em vista é de cerca de 1.000 a 10.000 fótons.

Quando a imagem tiver sido otimizada, adquira imagens de pilha Z repetidas da linha de base em intervalos regulares por pelo menos 15 minutos na velocidade 0 na esteira. Em seguida, defina a rotação da esteira para aproximadamente centímetros por segundo por 15 minutos enquanto adquire imagens 2pFLIM, seguidas por pelo menos 20 minutos de aquisição de imagem após desligar a rotação da esteira para avaliar a duração da atividade da proteína quinase A após a cessação da locomoção forçada.

Para análise de imagem 2pFLIM, abra as imagens na visualização de filme e clique nos campos de intervalo mínimo e máximo de contagem de fótons únicos para inserir os valores mínimos e máximos apropriados do intervalo de contagem de fótons únicos. Clique no campo de valor de tempo 0 para inserir o valor de tempo 0 e clique no campo de valor de limite mínimo de luminância de tempo de vida para inserir o valor de limite desejado entre 5 e 30 fótons.

Clique no botão Novo grupo e atribua um nome de grupo experimental para gerar um grupo que combine os dados de cada imagem FLIM adicionada. Clique em Região de interesse no módulo de controles da região de interesse e desenhe uma região de interesse em torno de um soma alfa-positivo T-ACCR. Mova o limite Z inferior e superior nos controles deslizantes da pilha Z para reduzir o intervalo da pilha Z e minimizar a contaminação do sinal originada de fótons de fundo e outros mergulhos em Z e clique em Mais para adicionar a imagem FLIM ao grupo.

Clique em calc para calcular o tempo de vida médio no erro de estimativa de tempo de vida para a região de interesse e abra o próximo arquivo na série de imagens 2pFLIM. Meça o mesmo soma alfa-positivo T-ACCR em cada imagem consecutiva ao longo do tempo, ajustando a região de interesse ao redor do soma conforme necessário. Quando todas as imagens tiverem sido analisadas, selecione o tempo médio de emissão de fótons delta T0 no módulo de controles de grupo e clique no campo número da linha de base para inserir o índice das imagens de interesse para definir as imagens usadas para calcular o tempo de vida da linha de base.

Em seguida, clique no gráfico para gerar um gráfico contendo a resposta FLIM à atividade alfa positiva do T-ACCR durante o experimento nas regiões de interesse definidas para permitir uma comparação da atividade da proteína quinase A durante a locomoção da quinase em diferentes regiões de interesse.