Imagem de lapso de tempo da migração radial de neurônios corticais em fatias de cérebro embrionário de camundongo transduzidas

Pegue uma inserção de membrana contendo fatias de cérebro organotípicas embrionárias de camundongo transduzidas, onde neurônios e células gliais radiais expressam proteínas fluorescentes, permitindo sua visualização.

Usando microscopia de fluorescência, selecione uma fatia com neurônios corticais fluorescentes migrando radialmente em direção à superfície pial da fatia usando andaimes gliais radiais intactos.

Transfira a inserção da membrana com a fatia selecionada para um prato com fundo de vidro com mídia para apoiar a atividade celular durante a imagem.

Coloque a placa na câmara climatizada do microscópio confocal invertido para garantir a viabilidade celular.

Ajuste os parâmetros de imagem para capturar imagens nítidas enquanto minimiza os fotodanos.

Em seguida, configure uma pilha Z na região de destino para visualizar estruturas celulares.

Inicie a imagem de lapso de tempo em intervalos regulares.

Analise as imagens para avaliar a migração radial dos neurônios corticais da zona subventricular em direção à placa cortical ao longo dos andaimes gliais radiais, destacando os padrões de migração neuronal.

Selecione uma fatia de cérebro para imagem visualizando as fatias através de um microscópio invertido. Escolha uma fatia com neurônios únicos brilhantes na SVZ superior, migrando radialmente em direção à superfície pial da fatia.

A presença de processos fluorescentes finos de células gliais radiais que abrangem toda a placa cortical indica um andaime glial radial intacto, que é usado por neurônios corticais migratórios.

Transfira o inserto da membrana com uma fatia selecionada para um prato com fundo de vidro de 50 milímetros de diâmetro contendo 2 mililitros de meio de cultura de fatias. Coloque o prato na câmara climática do microscópio confocal.

Defina a resolução para 512 por 512 pixels. Aumente a velocidade de varredura de 400 hertz para 700 hertz para aumentar a taxa de quadros de cerca de 1,4 para cerca de 2,5 quadros por segundo. Use no máximo duas vezes a média.

Defina uma pilha Z através da região eletroporada com um tamanho de passo de 1,5 mícrons. Comece a série de lapso de tempo fazendo uma pilha Z a cada 30 minutos. As configurações descritas permitem uma resolução e brilho suficientes da imagem, mantendo o fotodano baixo durante a aquisição.