Name: Ex vivo de imagens de pós-natal Cerebelar Granule migração celular Usando confocal Macroscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda a visualizar a migração de neurônios granulares em fatias cerebelares de ratos pós-natais usando microscopia confocal macro. Este método permite estudar fatores endógenos e substâncias tóxicas que regulam a migração neuronal.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Investigação e Inovação em Biomedicina (IRIB), a Plataforma de imagens de células de Normandy (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, da Universidade de Rouen, o Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER - Perene, Interreg 4A), o LARC-Neurociências Rede e da Região Haute-Normandie.

Animais (ratos Wistar machos ou fêmeas) foram nascidos e criados em uma facilidade animal acreditado (aprovação B.76-451-04), de acordo com o guia francês para o cuidado e uso de animais de laboratório. Os experimentos foram conduzidos sob a supervisão de investigadores autorizados (MB, DV e LG), em conformidade com a Directiva Europeia Conselho da Comunidade (2010/63 / UE, de 22 de setembro de 2010) e do Ministério da Agricultura francês. 1. Preparação de Mídia e Ferramentas <ol><li> Em uma câmara de segurança biológica, preparar BSS de 1x Hank (HBSS) em água estéril a partir da solução estoque 10x contendo CaCl2 (1,85 g / l) / MgSO 4 (0,9767 g / l), sem MgCl2. Adicionar NaHCO 3 (350 ug / ml) para 1x solução de HBSS. </li><li> Em uma câmara de segurança biológica, adicionar suplemento de N2 (a partir de uma solução estoque de 100x) e penicilina (100 unidades / ml) -streptomycin (0,1 mg / ml) solução de meio de Eagle modificado (DMEM), mistura nutriente de Dulbeccotura F-12 (1: 1). </li><li> Em condições estéreis, preparar uma aliquota (25 uL, 2 mM) do corante fluorescente citoplasmática chamada celular Rastreio verde em DMSO (1,075 ml para 1 mg). Dilui-se uma alíquota de 5 ml de meio DMEM num tubo de 15 ml. </li><li> Prepare cheio de gelo balde para manter media a 4 ° C. </li><li> Descontaminar bancadas de laboratório e ferramentas com etanol 70%. </li></ol> 2. Dissecção da Cerebelo de P10 Rats <ol><li> Rapidamente decapitar filhotes de ratos (P10) com uma tesoura operacionais curvas atrás das orelhas, a fim de obter o início da medula espinhal. </li><li> Ao lado de volta o da cabeça decapitada, fazer incisão mediana da pele do pescoço até o nariz com íris finas tesouras e separar a pele do crânio com íris finas tesouras e fórceps Dumont # 3. </li><li> Use tesouras finas íris delicadamente para fazer duas incisões laterais a partir da base para a região rostral do crânio. Remover o crânio dissecado com dois # 3 fórceps. Retire o sutiãa partir de qualquer aderência com o crânio utilizando as mesmas pinças. </li><li> Transferir o cérebro, com o fim de colher uma espátula para uma placa de Petri (Ø 35 mm), contendo 2 ml de meio de HBSS arrefecido com gelo. </li><li> Colocar a placa de Petri contendo o cérebro de um prato Petri maior (Ø 100 mm) cheia de gelo e transferência para a fase do estereomicroscópio. </li><li> Sob um microscópio estereoscópico, isolar o cerebelo do cérebro por dilaceração usando dois # 3 fórceps. De modo semelhante, remover a medula espinal e o residual da membrana pial. </li><li> Transferir o cerebelo em HBSS uma nova placa de Petri cheia (Ø 35 mm, 2 ml) com o fim de colher uma espátula e manter em gelo. </li></ol> 3. Preparação de agudos Cerebelar Slices <ol><li> Sob o microscópio estereoscópico, cortar o cerebelo entre vermis e o hemisfério direito como indicado pelas duas cabeças de seta na figura 2A com um cabo de bisturi padrão # 3 sólido e uma lâmina cirúrgica # 15. </li><li> Coloque uma gota de cianooacrylate cola no disco de amostra vibratome e esperar 15-25 seg para eliminar vapores de solventes tóxicos. </li><li> Recolher o cerebelo corte com o fim de colher uma espátula e remover o excesso de HBSS com toalhas de papel limpo. </li><li> Traga o cerebelo perto do disco de amostra. Fixe a borda de corte para o disco de amostra e esperar 10 segundos. </li><li> Insira o disco de amostra na bandeja de tampão com o manipulador, e gire-o para o eixo transversal do cerebelo é perpendicular ao titular da faca. Fixar o disco de amostra com uma chave Allen e preencher cuidadosamente a bandeja de tampão com meio HBSS até o cerebelo é coberto. </li><li> Carga de gelo picado para o banho de arrefecimento. </li><li> Limpar as lâminas três vezes com etanol a 70% para eliminar qualquer óleo. </li><li> Insira a lâmina no suporte para navalha e fixe com o parafuso de fixação. </li><li> Coloque o direito borda da lâmina atrás da extremidade traseira (do ponto de vista do usuário) da amostra e defini-lo como um ponto de partida. Use a frente comando para definir tele ponto final após o bordo da frente do espécime. </li><li> Selecione seccionamento velocidade a 2,5 e frequência de corte em 8. Selecione a espessura de corte a 180 mm. Iniciar o corte do tecido. </li><li> Pegue cada seção usando um copo grande de cano truncado Pasteur pipeta e transferir para HBSS contendo placa de Petri (Ø 35 mm) mantidos em gelo. </li><li> Usando dois # 5 pinça, retire cuidadosamente as meninges do cerebelo quando interfere com a lâmina. Recolhe um máximo de 5 fatias por cerebelo (Figura 2B, C). </li><li> Retire as meninges de as fatias de cerebelo cuidadosamente com dois # 5 fórceps sob o microscópio estereoscópico e separar os lóbulos suavemente para melhor carregamento da sonda. </li></ol> 4. fluorescente Coloração de Interneurônios de Vida <ol><li> Transferir fatias cerebelares com uma pipeta de Pasteur de vidro grande calibre truncado para uma placa de 6 poços (max 3 fatias / por cavidade). Aspirar o meio HBSS. </li><li> Incubar fatias (3 no máximo) em 5 ml de loading solução do corante fluorescente (10 uM). </li><li> Para proteger da luz, cobrir a microplaca com papel alumínio. Coloque-o sobre uma mesa giroscópio em movimento a 35 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente para facilitar a rotulagem celular. </li><li> Fatias de transferência na membrana de um Transwell insere (3,0 mm de tamanho de poro; Figura 2D) com uma pipeta Pasteur de vidro wide-bore truncado. Aspirar o meio de carga com pipeta. </li><li> Remova a inserção e encher o poço com 1,9 ml de DMEM. Substituir o inserto e adicionar 100 ul de DMEM em cima da fatia para cobrir o tecido. </li><li> Colocar a placa contendo as inserções de cultura na câmara incubadora (37 ° C, 5% de CO2) durante 2 horas o que é suficiente para observar GCs no ML. Deite tecidos lisos para permitir a ligação na membrana de inserção (Figura 2E). Certifique-se de que as fatias não estão secando. </li></ol> 5. Ex vivo de imagens Através confocal Macroscopia <ol><li> Transferir a placa sema tampa de plástico em uma incubadora ligada ao suporte de um macroscope confocal. Coloque uma tampa de vidro sobre a inserção da placa macroscope. Manter a temperatura da câmara a 37,0 ° C ± 0,5 ° C, e fornecer as fatias com fluxo constante de gases (95% O2, 5% de CO 2) através da placa de inserção para manter o pH constante. Espere por mais 2 horas antes da experiência de lapso de tempo. </li><li> Para visualizar a distância de migração GC nas fatias de tecido, iluminar a preparação com uma luz de comprimento de onda de 488 nm por meio de um diodo de laser através de um macroscópio confocal de varrimento laser equipado com uma objectiva seco X2 (de trabalho: 39 mm, diâmetro: 58 mm, NA = 0,234), e detectar emissão de fluorescência 500-530 nm. <ol><li> Para resolver finamente o movimento de GCs, aquisição de imagens com um fator de zoom óptico adicional de 1,5 a 2,0. Recolha de imagens GNs num único plano focal ou até 10 diferentes planos focais ao longo do eixo z a cada 30 min até 12 h. </li></ol></li&gt; <li> Quando necessário, retire a tampa de vidro e adicionar pequenos volumes (1-10 ul) de ativadores ou inibidores biológicos em DMEM com uma pipeta 10 ul para estudar seu efeito sobre a migração GC. </li></ol> Rastreamento 6. celular <ol><li> Para cada momento do filme, execute projeção z-stack através do modo de tipo ecart em ImageJ. Modular o contraste e os níveis de brilho das imagens sucessivas para facilitar a identificação e o seguimento dos GCs rotulados. Mapa manualmente cada posição no instantâneo de referência (a t = 0). <ol><li> Use o plugin &quot;Rastreio manual&quot; no Menu Particle Analisar e determinar clicando no ponto de gravidade de cada corpo celular durante lapso de tempo. Exportar os dados de rastreamento de matérias em uma planilha. </li></ol></li><li> Reorganizar os dados de rastreamento de matérias exportadas de ImageJ com um programa inteligente home-made (http://primacen.fr, escrito em código PHP) que identificam cada célula e posições associadas. Usando o programa, calculatè A distância total percorrida ea velocidade média de migração para cada célula. Classificar e comparar as características de migração de células em condições de controlo e de tratamento sob filtros apropriados utilizando o mesmo programa. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve a cultura de fatias de ratos P10 cerebelares agudos no sistema Transwell e a marcação fluorescente de GC com um corante fluorescente verde para estudar a migração de células durante o desenvolvimento pós-natal através macroscópica confocal. Este protocolo permite a migração de células de observações durante um período de até 12 horas e os testes de funções possíveis de factores, incluindo a migração de agonistas ou antagonistas de neuropéptidos, inibidores de enzimas, moduladores de sinalização celular e substâncias tóxicas, durante o experimento de regulação. Um pequeno orifício na inserção da membrana com uma ponta de pipeta é necessário para facilitar a administração dos compostos no meio de incubação. Uma curva ponteira caseiras podem ser usadas para facilitar a libertação da solução. Uma questão de estudos de migração celular em fatias de tecido vivo é que os movimentos do próprio tecido pode tornar difícil rastrear celular. Considerando que as abordagens anteriores têm proposto para estabilizar suavemente SLIces com uma malha de nylon ou uma fina camada de colagénio de cauda de rato 7,17, uma vantagem principal desta tecnologia é a transferência simples e directo de uma placa de cultura de 6 poços contendo fatias cerebelares sobre inserções de membrana a partir da incubadora de CO 2 no âmbito do objectivo de um macroscópio confocal. Controladores de temperatura integrado e CO 2 também fornecer parâmetros ambientais pertinentes e constantes essenciais para a migração celular 9. Portanto, as condições de cultura são mantidos durante as observações e movimentos dos tecidos são minimizados uma vez que as fatias são bem ligado à inserção da membrana. Estabilização do tecido é verificado, seguindo a posição de corte ou arestas células de Purkinje, que se pode fixar referências durante a aquisição. Além disso, as fatias de cerebelo (entre 12 e 18) distribuídos nas 6 cavidades da placa pode ser rapidamente observado em detalhe com uma platina motorizada e um zoom óptico. Devido à grande distância de trabalho (X2, 39 mm), do objectivo seco, epi-observation é livre de imersão e a administração de compostos no meio de cultura é muito mais fácil. Portanto, os parâmetros ambientais e semelhanças de apoio a cultura em incubadora de CO 2 e confocal MACROSCOPIA levar a conservação máximo da amostra biológica. Uma outra vantagem do protocolo é o grande campo de visão e, consequentemente, o grande número de células que podem ser observados simultaneamente. Por exemplo, temos anteriormente determinado que a densidade dos GCs fluorescentes com migração radial no ML foi 1124 ± 138 células / mm 2 18. Macroscopia confocal (X2, NA = 0,234) tem uma resolução lateral inferior em comparação com a microscopia confocal (40X, NA = 1,25), mas célula corpos de GCs podem ser facilmente rastreados e da velocidade média de migração é comparável entre os dois tecnológico aproxima 7,18 . Além de aprimoramento técnico para aquisições de imagem, a qualidade de fatias de tecido e the qualidade de rotulagem são pontos-chave para experiências bem-sucedidas. Sempre mantenha mídia e tecidos em gelo durante os processos de dissecação, eliminar óleo no vibratome lâminas e não utilizam fatias de tecido em contato com cola. Cortes sagitais e transversais são adaptados para a migração radial e tangencial, respectivamente. Use diferentes comprimentos de incubação para a detecção apropriada nas diferentes camadas corticais do cerebelo. Longos tempos de incubação (para cima de 8 h) são necessárias para a detecção da migração de numerosos GCs no PCL e a IGL. Uma vez que a migração de GC é um processo fisiológico durante as janelas de espaço-temporais específicas, o controlo positivo é de que as células têm de migrar adequadamente. Em particular, numerosos CG fuso no ML é um dos principais indicadores de saúde para fatias sagitais cerebelares. Para iniciar experimentos, sugere observação dos movimentos GC no ML. Com efeito, a forma do corpo da célula com GC verticalmente alongado deve ser considerada como um ponto de referência para iniciar acaqui- com controlo sucessivo (2 horas) e o tratamento (2 horas) períodos que podem ser facilmente realizados na ML. Corantes fluorescentes, como a família Rastreio celular ou proteínas fluorescentes expressas através de construções genéticas pode ser usada como marcadores em estudos de migração celular. Devido à cinética lenta migração de GC (uma pilha de cada 30 min), as experiências multicolor também pode ser realizada em modo sequencial desde 4 lasers vigas (405, 488, 532 e 633 nm) estão disponíveis no sistema. Considerando migração radial centrífuga e centrípeta, rastreamento de outros interneurónios também pode ser realizado 18. Em particular, menos numerosos tipos de células pode ser mais facilmente localizada com um grande campo de visão. Finalmente, este protocolo pode ser utilizado para estudar a migração celular nas outras fases de desenvolvimento do cerebelo, mas também de outras áreas do cérebro.

No cerebelo em desenvolvimento, oito tipos diferentes de neurónios são produzidos sequencialmente entre a segunda semana embrionário e pós-natal, a segunda semana em roedores 1. Originário inicialmente a partir de, uma zona germinal primário, as células granulares imaturos (GC) são os últimos neurônios a serem produzidos a partir da camada externa granular (EGL), uma zona germinal secundário 2. Durante as três primeiras semanas pós-natal, do córtex cerebelar é uma estrutura folheada organizada em quatro camadas, incluindo da EGL, a camada molecular (ML), a camada de Purkinje célula (PCL) e a camada granular interna (IGL) (Figura 1). Através de migração centrípeta, imaturo GCs, interneurônios glutamatérgicos, chegar ao IGL dentro de aproximadamente dois dias. Na terceira semana pós-natal, a EGL desaparece ea IGL constitui o que é chamado a camada granular (GL) no cerebelo de adultos. No GL, GCs receber entradas sináptica excitatória de fibras cobertas de musgo e células escova unipolares, eentradas sinápticas inibidores de axónios de células de Golgi. No ML, os axônios GC fazer sinapses excitatórias com neurônios gabaérgicos, incluindo células de Purkinje, as células cesta, células estreladas e células de Golgi 2. Observação em tempo real do movimento de células em fatias cerebelares agudos obtidos a partir de roedores pós-natais precoces demonstra que os GC modificar a sua forma concomitante com alterações na modalidade e a velocidade de migração durante o seu percurso no córtex cerebelar 3. Durante os primeiros dois dias pós-natais, precursores GC proliferam activamente na parte superior da EGL. Na parte média da EGL, pós-mitótico GCs migrar tangencialmente na direcção do seu processo maior. Na fronteira EGL-ML, GCs retardar seu movimento, as células começam a entrar em um processo descendente vertical curta para o ML. No ML, GCs têm um corpo celular verticalmente alongada, um processo de fuga fina e um processo que conduza mais volumoso, e migrar radialmente ao longo das fibras gliais Bergmann. NoPCL, GCs parar o seu movimento, mas depois de uma fase estacionária prolongada (2 horas), eles atravessam a fronteira PCL-IGL. No IGL, GCs migrar para a parte inferior da camada, na ausência de suporte de fibra glial. Uma vez que as pontas do processo conducente aproximar da fronteira importa IGL-branco (WM), GCs lento e parar seu movimento. Cortes transversais do cerebelo são preferidos para estudos de migração tangenciais na EGL enquanto fatias sagital são dedicados a migração radial no ML, PCL e IGL. Alguns factores reguladores de movimentos GC incluindo neuropeptídeos (por exemplo, somatostatina, PACAP) foram identificados até agora, mas os mecanismos completos envolvidos no controle espaço-temporal da migração de GC em cada camada cortical ainda são 1,4,5,6 em grande parte desconhecida. Migração GC foi estudado durante os últimos 20 anos através de vídeo e microscopia confocal usando iluminação de luz transmitida para as células cultivadas isoladas ou detecção de fluorescência para acufatias de cerebelo te. Inicialmente DII lipofílicos, e, mais recentemente, &quot;celular&quot; Rastreio de corantes fluorescentes e as proteínas expressas de células foram usadas para confocal ou microscopia de dois fotões 7,8. Experiências bem sucedidas dependem de um número de procedimentos específicos que tornam o protocolo simples, mas não é fácil. Em particular, fatias aguda têm que ser estabilizadas durante observações geralmente com uma rede de malha de nylon caseira 9. A intensidade de luz de iluminação deve ser tão baixa quanto possível para evitar a fototoxicidade e foto-branqueamento, tal como proposto por varrimento multiponto abordagem microscópio confocal. Além disso, a temperatura e CO 2 são parâmetros ambientais fundamentais pois a instabilidade pode afetar a migração neuronal. Para facilitar e aperfeiçoar os procedimentos experimentais, temos desenvolvido um protocolo macroscopia confocal que limita movimentos fatia, assegura parâmetros ambientais constantes, reduz fotodegradação, campo de visão aumenta (da ordem de milímetros) e consequtemente o número de células (dezenas) que podem ser rastreados através de análise de imagem. Assim, 180 mm fatias grossas são cultivados em inserções de membrana e placas de 6 poços são transferidos diretamente sob um objetivo motorizado 2X de um macroscope confocal comercial equipado com uma grande câmara de incubação, temperatura e CO 2 controladores e um sistema de controle de vibração. Time-lapsos e z-stacks são, então, realizada ao longo de várias horas e ferramentas farmacológicas ou moléculas bioativas podem ser adicionados ou entregues no meio de incubação. Este método também poderia ser usado para estudar a migração dos outros tipos de neurónios no cérebro cerebelo ou em diferentes estágios de desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s mistura de nutrientes de meio de águia modificado (DMEM) F-12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1641</td><td></td></tr><tr><td>PACAP38</td><td>INRS, Canadá</td><td></td><td>Bourgault et al., 200919</td></tr><tr><td>PAI-1</td><td>Calbiochem</td><td>528208</td><td></td></tr><tr><td>N-2 suplemento</td><td>Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen</td><td>O973</td><td></td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Verde CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Poliéster Transwell-Clear inserções</td><td>Corning</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>cluster de cultura de células de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos 35 mm de diâmetro</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos Thermo</td><td>SCIENTIFIC</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polipropileno (15 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Fisher Chemical</td><td>E/0800DF/21</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de segurança biológica capela de exaustão</td><td>Thermo Scientific</td><td>MSC9 Classe II A2</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de volume ajustável (0,5-10 &micro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>4910 000.018</td><td></td></tr><tr><td>Giroscópio, SSL3</td><td>Stuart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubadora, Hera Cell 150</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrótomo de lâmina vibratória, VT1000S</td> Macroscópio confocal <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, TCS LSI</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>PeCon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-controlador</td><td>Estereomicroscópio PeCon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, M205 C</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de operação, curva, romba/romba</td><td>Medicon</td><td>03.03.17</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de íris fina endurecida, reta, afiada/afiada</td><td>FST</td><td>149090-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Dumont #3 e #5</td><td>FST</td><td>11293-00 e 11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas injetoras de vibrato/borda única</td><td>Leica Microsystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi padrão #3</td><td>sólido FST</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica #15</td><td>Swann-Morton</td><td>205</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo de imagens de pós-natal cerebelar granule migração celular usando confocal macroscopia

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Durante o desenvolvimento pós-natal, células granulares imaturos (interneurónios excitatórios) exibem migração tangencial na camada granular externa, e, em seguida, a migração radial na camada molecular e a camada de células de Purkinje para alcançar a camada granular interna do córtex cerebelar. Padrão em processos migratórios induz ou morte celular ou extravio dos neurônios, levando a déficits em diversas funções do cerebelo. Migração de células granulares centrípeta envolve vários mecanismos, tais como a quimiotaxia e a degradação da matriz extracelular, para guiar as células para a sua posição final, mas os factores que regulam a migração celular em cada camada cortical estão apenas parcialmente conhecida. No nosso método, fatias agudas cerebelares são preparadas a partir de ratos P10, células granulares são marcadas com um marcador fluorescente citoplasmática e os tecidos são cultivadas em insertos de membrana de 4 a 10 horas antes de iniciar a monitorização em tempo real da migração das células por macroscópica confocal a 37 ° C nopresença de CO 2. Durante a sua migração nas diferentes camadas corticais do cerebelo, as células granulares podem ser expostas a agonistas ou antagonistas do neuropéptido, inibidores de protease, bloqueadores de efectores intracelulares ou mesmo substâncias tóxicas, tais como o álcool ou metilmercúrio para investigar o seu possível papel na regulação da migração neuronal .

No cerebelo pós-natal precoce, GCs apresentam mudanças significativas no seu modo e velocidade de migração como eles cruzam diferentes camadas corticais 1 (Figura 1). Esta secção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos através do estudo de migração de GC no seu meio celular natural. P10 fatias de tecido cerebelar de rato marcada com um corante fluorescente verde são examinadas sob um macroscópio confocal (Figura 3A), onde se mostra que os GC migrar radialmente no ML com uma velocidade média de 18 um / h (Figura 3B, C). Até à data, o papel das interacções / comunicação entre as células neuronais e gliais, incluindo os factores de regulação e os mecanismos moleculares envolvidos no controle da migração celular em cada camada cortical estão em grande parte desconhecida. Consequentemente, a questão principal é identificar os neuropeptídeos, neurotransmissores, neurotrofinas e componentes da matriz extracelular que poderiam desempenhar um papel nestes cortical camada específicafic mudanças de velocidade durante o seu processo de migração. Pituitária adenilato-ciclase de activação (PACAP) é detectada principalmente no PCL, mas também na ML e a IGL durante as primeiras duas semanas pós-natal em roedores 7,10,11. Aplicação de PACAP38 (10 -6 M) ao meio de cultura resultou numa diminuição de 79% da velocidade da GC na ML. Por exemplo, a velocidade de migração dos GCs em ML caiu de 11,9 uM / h em condições de controlo de 2,5 um / h após a administração de PACAP38 (Figura 4A). -Activador do plasminogénio tecidular (tPA) é um membro da cascata proteolítica que leva à degradação dos componentes da matriz extracelular (MEC), tais como moléculas de adesão celular ou laminina 12,13. tPA e plasminogénio, um substrato de tPA, são detectados em camadas corticais durante o desenvolvimento do cerebelo 14,15,16 pós-natal. A administração de PAI-1 (10 -7 M), um inibidor endógeno de tPA, reduzida em 78% a CGmigração no ML. Por exemplo, os GC reduzida velocidade de migração no ML de 19,2 uM / h em condições de controlo a 4,2 um / h após a adição de PAI-1 (Figura 4B). Estes resultados indicam que o PACAP exerce um efeito inibidor directo sobre os movimentos de GC e que a serina-protease de tPA facilita a migração dos GCs em ML do cerebelo de rato em desenvolvimento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig1.jpg" /> Figura 1: Representação 3D da migração GC no córtex cerebelar pós-natal. 1-4, Extensão dos processos de GC e migração tangencial no EGL. 5, Radial migração no ML ao longo das fibras gliais Bergmann. 6, fase estacionária Transient no PCL. 7, a migração glial-independente radial na IGL. 8, de Conclusão migração de GC no IGL GC, de células granulares, em vermelho;. EGL, Camada granular externa; B, Bergmann glia, em roxo escuro; G, células de Golgi, em amarelo; cf, escalada fibras, em azul; g, células granulares postmigratory, em verde claro; IGL, camada granular interna; mft, fibras musgosas terminal, em verde escuro; ML, camada molecular; P, células de Purkinje, em roxo luz; camada de células PCL, Purkinje. Este valor foi modificado a partir do 5. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig2.jpg" /> Figura 2: ex vivo cultura de fatias de cerebelo P10 (A) cerebelo de rato dissecado a partir de P10.. Barra de escala = 6 mm. (B) Micrografia de viver 180 um de espessura fatia cerebelar através de estereomicroscopia. Barra de escala = 3 mm. (C) Nouma ampliação mais elevada, as quatro camadas corticais (EGL, ML, PCL, IGL) do cerebelo já são distinguíveis. Escala da barra = 1 mm. (D) Após a marcação fluorescente, fatias de tecido são colocados em inserções de cultura (24 mm de diâmetro) numa placa de 6 poços. (E) Representação esquemática de uma inserção de cultura com membrana de poliéster de cultura de tecidos tratados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52810/52810fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig3.jpg" /> Figura 3: migração dinâmica de GCs nas camadas corticais de rato P10 cerebelo (A) vista Macroconfocal (xyz, projeção 2D) de uma fatia do cerebelo P10 rato em que os GCs são marcadas com um corante fluorescente do citoplasma verde.. Barra de escala = 75 mm. (B) de imagem Time-lapse que mostra GCmovimentos no ML por macroscopia confocal para 4 horas em condições de controle. Asterisco (*) marca o símbolo soma GC. O tempo decorrido (em min) está indicado na parte inferior de cada fotomicrografia. Escala da barra = 10 m. (C) alterações sequenciais na distância percorrida por GC soma. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig4.jpg" /> Figura 4:. Efeito do neuropéptido e de inibidor de protease de migração GC (A) GC foi rastreado no ML macroscópica confocal durante 2 horas em condições de controlo e, em seguida, durante 2 horas, na presença de pituitária adenilato-ciclase de activação (PACAP). (B) A GC foi rastreado no ML macroscópica confocal durante 2 horas em condições de controlo e, em seguida, durante 2 horas na presença de inibidor do activador do plasminogénio-1 (PAI-1).

Durante o desenvolvimento do cerebelo pós-natal, as células granulares imaturas originárias da zona germinativa exibem modalidades distintas de migração para chegar ao seu destino final e estabelecer redes neuronais. Este protocolo descreve a preparação de fatias cerebelares e a abordagem macroscópica confocal utilizada para investigar os fatores que regulam a migração neuronal.

Ex vivo de imagens de pós-natal Cerebelar Granule migração celular Usando confocal Macroscopia

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar neurônios em migração em fatias cerebrais vivas. Isso é realizado primeiramente dissecando o cerebelo de uma rata P10. Os próximos passos são preparar fatias cerebelares agudas e marcar os neurônios com uma sonda fluorescente.Em seguida, o experimento de lapso de tempo é realizado por meio de imagem confocal macroscópica ou microscopia confocal. O passo final consiste em rastrear os neurônios nos filmes resultantes. Em última instância, a microscopia ex vivo é utilizada para demonstrar o papel de fatores endógenos ou substâncias tóxicas que regulam a migração neuronal.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia confocal, é que a imagem macroconfocal aumenta o campo de visão, permitindo que fatias de cérebro sejam colocadas diretamente sobre o inserto de groel. Tive pela primeira vez a ideia para este método quando enfrentava dificuldades para transferir e estabilizar fatias de cérebro para experimentos de microscopia confocal. Comece acessando o crânio da cabeça de uma ratazana P10 decapitada, usando uma tesoura fina de íris, faça delicadamente duas incisões laterais da base até a região rostral do crânio. Em seguida, remova o crânio dissecado com uma pinça número três, rompendo qualquer aderência entre o cérebro e o crânio.Agora, retire o cérebro com a extremidade em colher de uma espátula e coloque-o em uma placa de Petri de 35 milímetros com dois mililitros de HBSS frio sobre gelo. Em seguida, sob um microscópio estereoscópio, isole o cerebelo do cérebro por meio de incisões D usando duas pinças número três. Transfira o cerebelo com a colher para um novo recipiente com tampão gelado.Em seguida, utilizando as mesmas ferramentas, remova e descarte o cordão espinhal residual e a membrana de pele. Prepare um cabo de bisturi sólido número três com uma lâmina cirúrgica número 15. Usando a lâmina sob um microscópio estereoscópico, corte o cerebelo entre o verme e o hemisfério direito.Agora, no vibratomo, coloque uma gota de cola de cianocrilato no disco do espécime e aguarde de 15 a 25 segundos para que os vapores do solvente se dissipem antes de transferir o cerebelo para o disco. Em seguida, fixe a borda do cerebelo ao disco do espécime e aguarde 10 segundos. Agora, utilizando o manipulador, insira o disco do espécime na bandeja de buffer de modo que o eixo transversal do cerebelo fique perpendicular ao suporte da lâmina.Certifique-se de fixar o disco usando uma chave de alumínio. Em seguida, cubra cuidadosamente o cerebelo com HBSS e adicione gelo picado ao banho de resfriamento. Para cortar o espécime, posicione uma lâmina limpa de modo que sua borda fique logo atrás da borda posterior do espécime.Defina este ponto como o ponto inicial para o congelamento. Em seguida, use o comando para frente para definir o ponto final logo após a borda frontal do espécime. Agora, ajuste a espessura do corte para 180 micrômetros.Em seguida, ajuste a velocidade de corte para 2,5 e a frequência para oito, e inicie o corte do espécime. Colete até cinco fatias por cerebelo. Recolha cada seção utilizando uma pipeta de vidro larga truncada.Transfira as seções para um recipiente contendo HBSS frio sobre gelo. Após coletar as fatias sob um microscópio estereoscópico, remova cuidadosamente as meninges usando duas pinças número cinco. Além disso, separe suavemente as LOEs para melhor carregamento da sonda.Após cortar o espécime, utilize uma pipeta larga truncada para transferi-los com algum HBSS para uma placa de seis poços, colocando até três fatias em cada poço. Em seguida, após esvaziar o meio em cada poço carregado, adicione cinco mililitros da solução de marcação contendo 10 micromolares do corante fluorescente, protegendo as amostras da luz, e cubra a placa com papel alumínio. Em seguida, coloque a placa em um agitador ajustado a 35 RPM.Deixe a placa incubando por 10 minutos em temperatura ambiente para permitir que o corante marque as células nos poços. Agora, transfira as fatias como antes para a membrana de um inserto tipo transwell que tenha poros de três mícrons. Em seguida, aspire o meio de carregamento, deixando apenas as fatias.Agora, remova o inserto e os fragmentos para preencher o poço com 1,9 mililitros de DMEM. Em seguida, recoloque o inserto e adicione mais 100 microlitros de DMEM para cobrir os tecidos. Incube esta preparação por duas horas, após as quais as células granulares ficarão visíveis.Transfira a placa sem a tampa para uma câmara ambiental com fluxo constante de gás em um microscópio confocal. Em seguida, coloque a lamínula sobre o inserto da placa do microscópio confocal para experimentos de lapso de tempo. Deixe as células incubarem na câmara por mais duas horas antes de prosseguir.Para visualizar as células granulares migrando nos cortes teciduais, ilumine o preparo com luz de 488 nanômetros e use uma objetiva seca de dois x. Detecte emissões fluorescentes de 500 a 530 nanômetros utilizando o ImageJ. Para cada imagem do filme com lapso de tempo, realize uma projeção Zack usando o modo de desvio padrão e ajuste os níveis de contraste e brilho de cada imagem para que as células granulares marcadas fiquem fáceis de visualizar. Agora, selecione o plugin de rastreamento manual no menu de análise de partículas.Utilize o plugin para clicar no ponto central de cada corpo celular rotulado ao longo da sequência de imagens do lapso de tempo. Em seguida, exporte os dados brutos de rastreamento para uma planilha para análise adicional. Reorganize os dados brutos exportados do Image J com uma ferramenta caseira inteligente que identifica cada célula e as posições associadas usando o programa.Calcule a distância total percorrida e a velocidade média de migração para cada célula. No cerebelo pós-natal inicial, as células granulares exibem mudanças significativas em seu modo e velocidade de migração ao atravessarem diferentes camadas corticais. Células granulares marcadas com CTG em fatias de tecido cerebelar de ratos PM foram examinadas.Conforme descrito, as células granulares migraram radialmente na camada molecular com uma velocidade média de 18 mícrons por hora. Em seguida, outro preparo foi utilizado para testar o efeito de fármacos esperados para alterar a taxa de migração. A aplicação de pay cap 38 ao meio de cultura resultou em uma redução de 79% na velocidade das células granulares na camada molecular, uma queda para 2,5 mícrons por hora.A administração de PI um, um inibidor da TPA endógena, reduziu a velocidade da migração das células granulares em 78%, passando da velocidade controle para 4,2 mícrons por hora. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como rastrear células no balão teórico em desenvolvimento. Embora tente realizar este procedimento, é importante lembrar de fornecer parâmetros ambientais apropriados e constantes, essenciais para a migração celular após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para que pesquisadores na área das neurociências explorassem os processos olfativos no cérebro.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos um protocolo em tempo real videoimaging da migração neuronal no cérebro anterior mouse. A migração de viralmente etiquetados ou enxertado precursores neuronais foi gravado em fatias agudas vivo usando largo campo de imagem fluorescente, com um intervalo de aquisição relativamente rápida para estudar as diferentes fases da migração de células, incluindo as durações das fases estacionária e de migração e da velocidade da migração.

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

Source: Chan, U., et al., Utilizando a eletroporação pós-natal in vivo para estudar a morfologia dos neurônios do grânulo cerebelar e o desenvolvimento da sinapse. J. Vis. exp. (2021).Este vídeo demonstra a análise do desenvolvimento do neurônio do grânulo cerebelar por meio de imagens de fatias de tecido cerebral pré-fixadas de camundongos marcados com uma proteína fluorescente, capturar imagens Z-stack de alta resolução com um microscópio confocal e medir parâmetros estruturais, incluindo...

Visualizando a sinaptogênese de neurônios do grânulo cerebelar em diferentes estágios de desenvolvimento

Fonte: Bénard, M., et al. Ex Vivo Imagem da migração de células granulares cerebelares pós-natais usando macroscopia confocal. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra um método macroscópico confocal para rastrear a migração ex vivo de células granulares em fatias cerebelares de cérebros de ratos pós-natais.

Imagem ex vivo da migração de células granulares cerebelares pós-natais usando macroscopia confocal

Migração neuroblastos é um evento fundamental para a neurogênese pós-natal. Nós descrevemos um protocolo para a rotulagem eficiente de neuroblastos por eletroporação in vivo pós-natal e visualização posterior de sua migração utilizando time-lapse de imagens de fatias cerebrais agudas. Nós incluímos uma descrição para a análise quantitativa da dinâmica neuroblastos por rastreamento de vídeo.

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

Morfogênese neuronal ea migração são eventos cruciais subjacentes ao desenvolvimento do cérebro. Aqui, descrevemos os métodos para manipular geneticamente cultivadas neurônios granulares do cerebelo e do cerebelo em desenvolvimento para a avaliação da morfologia e características migratórias dos neurônios.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

A camada externa de grânulo cerebelar é o local da maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo para direcionar modificação genética a esta camada no pico de proliferação utilizando ex eletroporação vivo e cultura de fatias de cerebelo a partir do dia 14 embriões de galinha embrionárias.

Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

Aqui, nós fornecemos um método confiável e de baixo custo para gerar electroporated culturas do cérebro organotypic fatia de embriões do rato apropriados para microscopia confocal e técnicas de geração de imagens ao vivo.

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

Este protocolo descreve uma técnica crônica de implantação de janelas cranianas que pode ser usada para imagens longitudinais de estruturas neuro-glio-vasculares, interações e função em condições saudáveis e doentes. Serve como uma alternativa complementar à abordagem de imagem transcranária que, embora muitas vezes preferida, possui algumas limitações críticas.

Mapeamento cerebral preciso para realizar imagens repetitivas in vivo da dinâmica neuro-imune em camundongos

Aqui descrevemos um método para visualizar a sinaptogênese de neurônios de grânulos no cerebelo do rato ao longo do curso de tempo do desenvolvimento cerebral pós-natal, quando essas células refinam suas estruturas sinápticas e formam sinapses para se integrarem ao circuito cerebral geral.

Utilizando a eletroporação pós-natal in vivo para estudar a morfologia do neurônio do grânulo cerebelar e o desenvolvimento da sinapse

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Aprenda a visualizar a migração de neurônios granulares em fatias cerebelares de ratos pós-natais usando microscopia confocal macro. Este método permite estudar fatores endógenos e substâncias tóxicas que regulam a migração neuronal.

Ex vivo de imagens de pós-natal Cerebelar Granule migração celular Usando confocal Macroscopia

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