Ex vivo de imagens de pós-natal Cerebelar Granule migração celular Usando confocal Macroscopia

O objetivo geral deste procedimento é visualizar neurônios migratórios em fatias de cérebro vivas. Isso é feito dissecando primeiro o cerebelo de um rato P 10. Os próximos passos são preparar fatias cerebelares agudas e marcar os neurônios com uma sonda fluorescente.

Em seguida, o experimento de lapso de tempo é realizado por meio de imagem macro confocal ou microscopia confocal. A etapa final é rastrear os neurônios nos filmes resultantes. Em última análise, a microscopia ex vivo é usada para mostrar o papel de fatores endógenos ou substâncias tóxicas que regulam a migração neuronal.

A principal vantagem desta técnica de métodos existentes, como a microscopia confocal, é que a imagem macro confocal aumenta a sensação de visão de deixar fatias de arte cerebral diretamente colocadas na inserção da virilha. Primeiro, tive a ideia desse método quando tive dificuldades para transferir e estabilizar fatias de arte cerebral para experimentos de microscopia confocal Comece tendo acesso ao crânio de uma cabeça de filhote de rato P 10 decapitada, usando uma tesoura de íris fina delicadamente faça duas incisões laterais da base até a região rostral do crânio. Em seguida, remova o crânio dissecado com duas pinças número três, quebrando qualquer adesão entre o cérebro e o crânio.

Agora, retire o cérebro com a ponta da colher de uma espátula e coloque-o em uma placa de Petri de 35 milímetros com dois mililitros de HBSS frio no gelo. Agora, sob um microscópio estéreo, isole o cerebelo do cérebro por lacerações D usando duas pinças número três. Coloque o cerebelo em um novo prato com tampão gelado.

Em seguida, usando as mesmas ferramentas, remova e descarte a medula espinhal residual e a membrana de descasque. Prepare um cabo de bisturi sólido número três com uma lâmina cirúrgica número 15. Usando a lâmina sob um microscópio estéreo, corte o cerebelo entre o verus e o hemisfério direito.

Agora, no vibrato, coloque uma gota de cola de cianocrilato no disco da amostra e aguarde de 15 a 25 segundos para que o vapor do solvente se dissipe antes de transferir o cerebelo para o disco. Em seguida, fixe a borda do cerebelo ao disco da amostra e aguarde 10 segundos. Agora, usando o manipulador, insira o disco de amostra na bandeja tampão de forma que o eixo transversal do cerebelo fique perpendicular ao porta-facas.

Certifique-se de prender o disco usando uma chave de alumínio. Em seguida, cubra cuidadosamente o cerebelo com HBSS e coloque gelo picado no banho de resfriamento. Para cortar a amostra, posicione uma lâmina limpa, de modo que sua borda fique logo atrás da borda traseira da amostra.

Defina isso como o ponto de partida para o glacê. Em seguida, use o comando forward para definir o ponto final logo após a borda frontal da amostra. Agora defina a espessura da fatia para 180 mícrons.

Em seguida, defina a velocidade de corte para 2,5 e a frequência para oito, e comece a seccionar a amostra. Colete até cinco fatias por cerebelo. Pegue cada seção usando uma pipeta de vidro de javali larga truncada.

Transfira as seções para um prato contendo HBSS frio com gelo. Depois de coletar as fatias em um microscópio estéreo, remova cuidadosamente as meninges usando duas pinças número cinco. Além disso, separe cuidadosamente os LOEs para melhor carregamento da sonda.

Depois de fatiar a amostra, use uma pipeta de javali larga truncada para transferi-la com um pouco de HBSS para uma placa de seis poços, carregue até três fatias em cada poço. Em seguida, depois de esvaziar a mídia em cada carregado, adicione cinco mililitros de solução de carregamento contendo 10 micromolares do corante fluorescente para proteger as amostras da luz, cubra a placa com papel alumínio. Em seguida, coloque a placa em um mutador ajustado para 35 RPM.

Deixe a placa incubar por 10 minutos em temperatura ambiente para permitir que o corante rotule bem as células. Agora transfira as fatias como antes para a membrana de uma inserção transwell que tenha poros de três mícrons. Em seguida, aspire o meio de carga, deixando apenas as fatias.

Agora remova a inserção e as fatias para encher o poço com 1,9 mililitros de DMEM. Em seguida, coloque a inserção de volta e adicione mais 100 microlitros de DMEM para cobrir os tecidos. Incube esta preparação por duas horas, após as quais as células granulares serão visíveis.

Transfira a placa sem a tampa para uma câmara ambiental com fluxo de gás constante em um microscópio confocal. Em seguida, coloque a tampa de vidro na inserção da placa do microscópio confocal para experimentos de lapso de tempo. Deixe as células incubarem na câmara por mais duas horas antes de prosseguir.

Para visualizar as células granulares migrando nas fatias de tecido, ilumine a preparação com luz de 488 nanômetros e use uma objetiva seca de dois x. Detecte emissões fluorescentes de 500 a 530 nanômetros usando a imagem J. Para cada imagem do filme de lapso de tempo, execute uma projeção Zack usando o modo de desvio padrão, ajuste os níveis de contraste e brilho de cada imagem para que as células granulares marcadas sejam fáceis de ver. Agora, escolha o plug-in de rastreamento manual no menu de análise de partículas.

Use o plug-in para clicar no ponto central de cada corpo celular rotulado ao longo da sequência de imagens de lapso de tempo. Em seguida, exporte os dados brutos de rastreamento para uma planilha para análise posterior. Reorganize os dados brutos de rastreamento exportados da Imagem J com uma ferramenta caseira inteligente que identifica cada célula e posições associadas usando o programa.

Calcule a distância total de viagem e a velocidade média de migração para cada célula. No cerebelo pós-natal inicial, as células granulares exibem mudanças significativas em seu modo e velocidade de migração à medida que atravessam diferentes camadas corticais. Células granulares marcadas com CTG em fatias de tecido cerebelar de ratos PM foram examinadas.

Conforme descrito, as células granulares migraram radialmente na camada molecular com uma velocidade média de 18 mícrons por hora. Outra preparação foi então usada para testar o efeito de drogas que deveriam alterar a taxa de migração. A aplicação do pay cap 38 ao meio de cultura resultou em uma diminuição de 79% da velocidade das células granulares na camada molecular, uma queda para 2,5 mícrons por hora.

A administração de PI um, um inibidor do TPA endógeno, reduziu a velocidade de migração das células granulares em 78% da velocidade de controle para 4,2 mícrons por hora. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rastrear células no balão da teoria em desenvolvimento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fornecer parâmetros ambientais apropriados e constantes, essenciais para a migração celular após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo das neurociências explorarem os processos fatouários no cérebro.