Ex vivo de imagens de pós-natal Cerebelar Granule migração celular Usando confocal Macroscopia
12 de maio de 2015
Durante o desenvolvimento do cerebelo pós-natal, as células granulares imaturas originárias da zona germinativa exibem modalidades distintas de migração para chegar ao seu destino final e estabelecer redes neuronais. Este protocolo descreve a preparação de fatias cerebelares e a abordagem macroscópica confocal utilizada para investigar os fatores que regulam a migração neuronal.
O objetivo geral deste procedimento é visualizar neurônios migratórios em fatias de cérebro vivas. Isso é feito dissecando primeiro o cerebelo de um rato P 10. Os próximos passos são preparar fatias cerebelares agudas e marcar os neurônios com uma sonda fluorescente.
Em seguida, o experimento de lapso de tempo é realizado por meio de imagem macro confocal ou microscopia confocal. A etapa final é rastrear os neurônios nos filmes resultantes. Em última análise, a microscopia ex vivo é usada para mostrar o papel de fatores endógenos ou substâncias tóxicas que regulam a migração neuronal.
A principal vantagem desta técnica de métodos existentes, como a microscopia confocal, é que a imagem macro confocal aumenta a sensação de visão de deixar fatias de arte cerebral diretamente colocadas na inserção da virilha. Primeiro, tive a ideia desse método quando tive dificuldades para transferir e estabilizar fatias de arte cerebral para experimentos de microscopia confocal Comece tendo acesso ao crânio de uma cabeça de filhote de rato P 10 decapitada, usando uma tesoura de íris fina delicadamente faça duas incisões laterais da base até a região rostral do crânio. Em seguida, remova o crânio dissecado com duas pinças número três, quebrando qualquer adesão entre o cérebro e o crânio.
Agora, retire o cérebro com a ponta da colher de uma espátula e coloque-o em uma placa de Petri de 35 milímetros com dois mililitros de HBSS frio no gelo. Agora, sob um microscópio estéreo, isole o cerebelo do cérebro por lacerações D usando duas pinças número três. Coloque o cerebelo em um novo prato com tampão gelado.
Em seguida, usando as mesmas ferramentas, remova e descarte a medula espinhal residual e a membrana de descasque. Prepare um cabo de bisturi sólido número três com uma lâmina cirúrgica número 15. Usando a lâmina sob um microscópio estéreo, corte o cerebelo entre o verus e o hemisfério direito.
Agora, no vibrato, coloque uma gota de cola de cianocrilato no disco da amostra e aguarde de 15 a 25 segundos para que o vapor do solvente se dissipe antes de transferir o cerebelo para o disco. Em seguida, fixe a borda do cerebelo ao disco da amostra e aguarde 10 segundos. Agora, usando o manipulador, insira o disco de amostra na bandeja tampão de forma que o eixo transversal do cerebelo fique perpendicular ao porta-facas.
Certifique-se de prender o disco usando uma chave de alumínio. Em seguida, cubra cuidadosamente o cerebelo com HBSS e coloque gelo picado no banho de resfriamento. Para cortar a amostra, posicione uma lâmina limpa, de modo que sua borda fique logo atrás da borda traseira da amostra.
Defina isso como o ponto de partida para o glacê. Em seguida, use o comando forward para definir o ponto final logo após a borda frontal da amostra. Agora defina a espessura da fatia para 180 mícrons.
Em seguida, defina a velocidade de corte para 2,5 e a frequência para oito, e comece a seccionar a amostra. Colete até cinco fatias por cerebelo. Pegue cada seção usando uma pipeta de vidro de javali larga truncada.
Transfira as seções para um prato contendo HBSS frio com gelo. Depois de coletar as fatias em um microscópio estéreo, remova cuidadosamente as meninges usando duas pinças número cinco. Além disso, separe cuidadosamente os LOEs para melhor carregamento da sonda.
Depois de fatiar a amostra, use uma pipeta de javali larga truncada para transferi-la com um pouco de HBSS para uma placa de seis poços, carregue até três fatias em cada poço. Em seguida, depois de esvaziar a mídia em cada carregado, adicione cinco mililitros de solução de carregamento contendo 10 micromolares do corante fluorescente para proteger as amostras da luz, cubra a placa com papel alumínio. Em seguida, coloque a placa em um mutador ajustado para 35 RPM.
Deixe a placa incubar por 10 minutos em temperatura ambiente para permitir que o corante rotule bem as células. Agora transfira as fatias como antes para a membrana de uma inserção transwell que tenha poros de três mícrons. Em seguida, aspire o meio de carga, deixando apenas as fatias.
Agora remova a inserção e as fatias para encher o poço com 1,9 mililitros de DMEM. Em seguida, coloque a inserção de volta e adicione mais 100 microlitros de DMEM para cobrir os tecidos. Incube esta preparação por duas horas, após as quais as células granulares serão visíveis.
Transfira a placa sem a tampa para uma câmara ambiental com fluxo de gás constante em um microscópio confocal. Em seguida, coloque a tampa de vidro na inserção da placa do microscópio confocal para experimentos de lapso de tempo. Deixe as células incubarem na câmara por mais duas horas antes de prosseguir.
Para visualizar as células granulares migrando nas fatias de tecido, ilumine a preparação com luz de 488 nanômetros e use uma objetiva seca de dois x. Detecte emissões fluorescentes de 500 a 530 nanômetros usando a imagem J. Para cada imagem do filme de lapso de tempo, execute uma projeção Zack usando o modo de desvio padrão, ajuste os níveis de contraste e brilho de cada imagem para que as células granulares marcadas sejam fáceis de ver. Agora, escolha o plug-in de rastreamento manual no menu de análise de partículas.
Use o plug-in para clicar no ponto central de cada corpo celular rotulado ao longo da sequência de imagens de lapso de tempo. Em seguida, exporte os dados brutos de rastreamento para uma planilha para análise posterior. Reorganize os dados brutos de rastreamento exportados da Imagem J com uma ferramenta caseira inteligente que identifica cada célula e posições associadas usando o programa.
Calcule a distância total de viagem e a velocidade média de migração para cada célula. No cerebelo pós-natal inicial, as células granulares exibem mudanças significativas em seu modo e velocidade de migração à medida que atravessam diferentes camadas corticais. Células granulares marcadas com CTG em fatias de tecido cerebelar de ratos PM foram examinadas.
Conforme descrito, as células granulares migraram radialmente na camada molecular com uma velocidade média de 18 mícrons por hora. Outra preparação foi então usada para testar o efeito de drogas que deveriam alterar a taxa de migração. A aplicação do pay cap 38 ao meio de cultura resultou em uma diminuição de 79% da velocidade das células granulares na camada molecular, uma queda para 2,5 mícrons por hora.
A administração de PI um, um inibidor do TPA endógeno, reduziu a velocidade de migração das células granulares em 78% da velocidade de controle para 4,2 mícrons por hora. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rastrear células no balão da teoria em desenvolvimento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fornecer parâmetros ambientais apropriados e constantes, essenciais para a migração celular após seu desenvolvimento.
Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo das neurociências explorarem os processos fatouários no cérebro.
Visão Geral
Este estudo foca-se na migração de células granulares imaturas no cerebelo pós-natal, utilizando uma abordagem macroscópica confocal para visualizar o movimento neuronal em fatias cerebrais vivas. O protocolo descreve o preparo de fatias cerebelares e os fatores que influenciam a migração neuronal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Migração neuronal
- Microscopia confocal
Contexto
- As células granulares migram para estabelecer redes neuronais durante o desenvolvimento do cerebelo.
- Compreender a migração neuronal é essencial para obter insights sobre o desenvolvimento cerebral e distúrbios associados.
- A microscopia confocal permite a visualização detalhada do comportamento neuronal.
- A microscopia ex vivo pode revelar os efeitos de diversos fatores sobre a migração neuronal.
Objetivo do Estudo
- Visualizar a migração de células granulares no cerebelo.
- Investigar a influência de fatores endógenos e substâncias tóxicas sobre a migração neuronal.
- Aprimorar técnicas para o estudo da dinâmica neuronal em fatias cerebrais.
Métodos Utilizados
- Dissecação do cerebelo de rato P10 e preparação de fatias agudas.
- Marcação de neurônios com sondas fluorescentes para visualização.
- Imageamento com lapso de tempo usando microscopia confocal macro.
- Rastreamento do movimento neuronal e análise da velocidade e distância de migração.
Resultados Principais
- As células granulares exibiram mudanças significativas nos modos e velocidades de migração ao longo das camadas corticais.
- Verificou-se que a velocidade média de migração era de 18 mícrons por hora na camada molecular.
- A aplicação de drogas específicas alterou significativamente a velocidade de migração das células granulares.
- Os resultados fornecem informações sobre os mecanismos regulatórios da migração neuronal.
Conclusões
- O estudo visualiza com sucesso a migração de células granulares em fatias cerebelares.
- Os achados destacam o impacto de fatores endógenos sobre o movimento neuronal.
- Este método aprimora a compreensão da dinâmica neuronal durante o desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a visualização em tempo real da migração neuronal em fatias cerebrais vivas, apoiando a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos neurodesenvolvimentais. Ao quantificar a velocidade de migração e a dinâmica das trajetórias, fornece confiança preditiva para avaliar os efeitos de compostos sobre a circuitria neuronal. A abordagem conecta a biologia de descoberta com a avaliação pré-clínica de substâncias neuroativas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas por meio da visualização da migração de células granulares como indicador funcional da integridade das vias neuronais.
- Valor Operacional: Permite a redução de riscos biológicos por meio da observação direta dos efeitos de fatores endógenos e substâncias tóxicas sobre o movimento celular.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao associar alterações na migração a possíveis déficits funcionais na circuitaria cerebelar.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, estabelecendo a cinética basal de migração em camadas corticais.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio do rastreamento quantitativo da distância total percorrida e da velocidade média.
- Prontidão para Triagem: Destaca a escalabilidade e a reutilização da plataforma para avaliação confiável de compostos em formato de lapso de tempo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Discute a relevância para doenças ao conectar a desregulação da migração com déficits em diversas funções cerebelares.
- Avanço Ajustado ao Risco: Descreve a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de compostos neuroativos.
- Desriskagem Preditiva: Enfoca a compreensão mecanicista ao avaliar substâncias como álcool ou metilmercúrio sobre a migração neuronal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Posiciona o método dentro do continuum de descoberta, desde a verificação de hipóteses até a identificação de compostos líderes, apoiado pela sua capacidade de medir a migração como um ponto final funcional.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia o teste de hipóteses, a clarificação de vias e a desmistificação biológica dos mecanismos de migração neuronal.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio, a reprodutibilidade e as saídas quantitativas ao acompanhar o movimento das células granulares em resposta a compostos.
- Análises: Destaca as medições, leituras ou saídas estatísticas que ajudam as equipes a comparar a velocidade e a distância de migração entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica ou o alinhamento de biomarcadores somente quando apoiado pela fonte.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável, e não como uma técnica de uso único.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista nas vias de migração neuronal.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos protocolos de imageamento e rastreamento em tempo real.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre prosseguir ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados na triagem de compostos neuroativos.
- Impacto sobre o Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados de fenótipos de migração.
Considerações de Implementação
- Expertise científica necessária em neuroanatomia, marcação fluorescente e microscopia confocal.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica, incluindo câmara ambiental, microscópio confocal macroscópico e ImageJ com plugins de rastreamento.
- Requisitos de padronização entre equipes para preparo de fatias, consistência na marcação e quantificação da migração.
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo, como diferentes idades pós-natais ou espécies.
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem, incluindo janela de viabilidade das fatias e riscos de fototoxicidade durante imagens de longo prazo.
