Caracterização de células-tronco mesenquimais geneticamente modificadas para aplicações neuroterapêuticas

Comece com células-tronco mesenquimais de camundongos transgênicos - células multipotentes derivadas da medula óssea.

As células são projetadas para expressar GFP e fatores neurotróficos terapêuticos que apoiam o crescimento e a sobrevivência neuronal.

Lave as células com tampão e fixe-as para preservar a integridade celular.

Lave novamente com tampão e, em seguida, adicione uma solução para permeabilizar a célula e as membranas nucleares e bloquear locais de ligação não específicos.

Introduzir anticorpos primários direcionados a uma proteína marcadora de proliferação celular expressa exclusivamente no núcleo das células em divisão.

Lave com tampão para remover anticorpos não ligados.

Adicione anticorpos secundários conjugados com fluoróforo direcionados aos anticorpos primários e um corante de ligação ao DNA para contracorar os núcleos.

Lave com tampão para remover os reagentes não ligados.

Carregue a placa no sistema de triagem de alto conteúdo e capture imagens para detectar sinais fluorescentes.

A expressão do marcador de proliferação celular indica divisão celular ativa, sugerindo a adequação das células transgênicas para aplicações neuroterapêuticas.

Para realizar um ensaio de proliferação celular Ki-67, use tampão fosfato 0,1 molar para enxaguar as culturas de células por um minuto. Depois de repetir a lavagem, use paraformaldeído a 4%, ou PFA, em temperatura ambiente por 20 minutos para fixar as culturas.

Após a fixação, remova o PFA e use PBS para enxaguar os poços três vezes por sete minutos cada. Depois de bloquear as células de acordo com o protocolo de texto, aplique 100 microlitros de solução de anticorpo primário em cada poço. Cubra a placa e incube a 4 graus Celsius durante a noite.

Depois de lavar as células três vezes por sete minutos para cada lavagem, aplique anticorpos secundários, coloque as células no escuro e incube em temperatura ambiente por 90 minutos. Após mais três lavagens, cubra a placa e guarde-a a 4 graus Celsius até a imagem.

Para realizar imagens automatizadas, carregue a placa imunomarcada no sistema HCS e deixe a placa se equilibrar por 20 minutos. Abra o software de aquisição e análise de imagens do sistema HCS. Escolha as configurações de aquisição para a objetiva 10X usando o binning da câmera em 1 e a configuração de ganho de 2.

Use a função de exposição automática para encontrar o plano Z no qual as células residem e calcule o deslocamento para cada comprimento de onda de interesse. Para a análise demonstrada aqui, capture imagens para DAPI, GFP e Cy3.

Escolha o nível de intensidade máxima no qual os poços de controle negativo não mostram sinal para aquisição de imagem. Use as mesmas configurações de limite para poços positivos. Por fim, capture imagens e salve-as em um banco de dados, antes de realizar a análise de imagens de acordo com o protocolo de texto.