Name: Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley para terapias de regeneração pancreática e tratamento do diabetes. Este método auxilia pesquisadores na medicina regenerativa.

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Os autores agradecem ao Instituto Mexicano de Seguridade Social (IMSS) e ao Hospital Infantil do México, Federico Gomez (HIMFG) e à equipe de Biotério da Coordenação de Pesquisa do IMSS, pelo apoio dado para a realização deste projeto. Agradecemos ao Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia pela bolsa AOC (815290) e a Antonio Duarte Reyes pelo apoio técnico no material audiovisual.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados seguindo as Diretrizes Mexicanas para Cuidados com Animais, baseadas nas recomendações da Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, México). O protocolo foi revisado, aprovado e registrado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Saúde do Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).
1. Remoção de tecido adiposo de ratos por ressecção cirúrgica
<ol><li>Preparar dois tubos cônicos com 20 mL de solução antimicótica salina-antimicótica tamponada com fosfato 1x (PBS-AA) estéril (1x PBS, gentamicina [20 μg/mL] e anfotericina [0,5 μg/mL]) e manter no gelo.</li>
	<li>Selecionar dois ratos Sprague Dawley machos adultos (R. norvegicus) em boas condições de saúde. Certifique-se de que os ratos têm entre 3-4 meses de idade e têm um peso coporal de 350-450 g.</li>
	<li>Proceder à sedação com 20 mg/kg de cloridrato de xilazina e, 5 minutos após, administrar um anestésico com uma dose de 120 mg/kg de cloridrato de quetamina por via intraperitoneal. Lubrifique ambos os olhos com uma pomada oftálmica para evitar o ressecamento. Em seguida, confirme a profundidade da anestesia através da ausência do reflexo pedal.</li>
	<li>Raspar e desinfetar a região abdominal e inguinal com uma solução de iodo. Aplicar campos cirúrgicos para manter a esterilidade. Em seguida, faça uma incisão longitudinal mediana do esterno até a região testicular.</li>
	<li>Remova o tecido adiposo ao redor do epidídimo e dos rins com pinça estéril e coloque na solução de 1x PBS-AA. Mantenha as amostras no gelo.</li>
	<li>Sutura da incisão fechada se necessário de acordo com as diretrizes institucionais e eutanásia dos animais com dose intracardíaca de 40 mg/kg de pentobarbital sódico. Uma vez confirmado o óbito, descarte a carcaça seguindo procedimento(s) institucional(is). NOTA: A morte provoca mecanismos de sinalização que afetam o imunofenótipo, a capacidade de diferenciação e o efeito parácrino das células mesenquimais. Assim, a coleta de tecidos é realizada antes da eutanásia. </li>
</ol>2. Isolamento de células mesenquimais do tecido adiposo
<ol><li>Remova o tecido adiposo com pinça estéril dentro de um armário de biossegurança e coloque-o sobre papel de filtro estéril em uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro para absorver o excesso de PBS.</li>
	<li>Transferir o tecido adiposo para outra placa de Petri e realizar três lavagens por 5 min cada com 10 mL de solução 1x PBS-AA usando uma pipeta de 10 mL.</li>
	<li>Desagregar mecanicamente o tecido em fragmentos de aproximadamente 1cm2 com tesoura e bisturi.</li>
	<li>Preparar colagenase tipo IV (0,075%) em 20 mL de meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco não suplementado. Filtrar através de um filtro de seringa de 0,22 μm e manter a 37 °C.</li>
	<li>Adicionar a solução de colagenase (20 ml) preparada no passo 2.4 num copo de cristal com o tecido fragmentado e uma barra magnética. Selar o recipiente e incubar sob agitação lenta e contínua a 37 °C. NOTA: A digestão enzimática leva aproximadamente 90 min (manter a agitação lenta para preservar a integridade das membranas celulares).</li>
	<li>Filtrar o homogeneizado através de um filtro de aço inoxidável, tela de 40 mm, abertura de 0,38 mm em uma placa de Petri de 100 mm e coletar a suspensão celular em um tubo cônico estéril de 50 mL.</li>
	<li>Adicionar 20 mL de DMEM aquecido e suplementado (10% de soro fetal bovino [SFB], 2 mM de glutamina, 2 mM de piruvato de sódio, 100x solução de aminoácidos não essenciais e 100x de solução antimicótica antimicótica [AA]). Suspender cuidadosamente a fração vascular estromal (VED).</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular a 290 x g por 10 min, descartar o sobrenadante com pipeta de 25 mL e lavar suavemente as células com 40 mL de meio DMEM não suplementado.</li>
	<li>Repita esta etapa. Use um novo tubo cônico estéril entre os passos para arrastar a menor quantidade de detritos celulares e gordura.</li>
	<li>Suspender o pellet em 5 mL de DMEM suplementado com pipeta de 5 mL e transferir para um frasco T-25 cm2 . Incubar durante 24 h a 37 °C e 5% CO2.</li>
	<li>No dia seguinte, realizar três lavagens com 5 mL de PBS-AA aquecido 1x e duas lavagens com DMEM não suplementado para remoção de restos celulares e células não aderentes. Adicione 5 mL de DMEM fresco, aquecido e suplementado com uma pipeta de 5 mL e troque o meio a cada 3-4 dias.</li>
</ol>3. Manutenção e expansão das culturas primárias da ASC
<ol><li>Quando as células atingirem 90%-100% de confluência (8 ± 2 dias), lavar duas vezes com 5 mL de DMEM não suplementado. Adicionar 1 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,025% aquecido a 0,025% mM e incubar por 5-7 min a 37 °C.</li>
	<li>Quando a monocamada celular estiver destacada, adicionar 4 mL de DMEM suplementado e desagregar suavemente a suspensão celular.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL, adicione 5 mL de DMEM aquecido e suplementado e suspenda suavemente para homogeneizar.</li>
	<li>Centrifugar a 290 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante e misture suavemente o pellet em 1 mL de DMEM suplementado. Contar as células numa câmara de Neubauer após coloração com azul de Trypan.</li>
	<li>Por fim, semea-se 2,5 x 103 células/cm2 na proporção de 1:4 em frascos T-75. Essa etapa garante a formação de colônias e uma alta taxa de proliferação.</li>
</ol>4. Caracterização morfológica de culturas primárias de ASC
<ol><li>Observar a morfologia das CTAs sob microscopia invertida. NOTA: Antes da montagem para identificação histológica e ASC, trate as lamínulas com uma solução de gelatina a 1%. Irradiar com UV por 15 min.<ol><li>Retire as lamínulas da solução de etanol a 70% e deixe-as secar por 5 min.</li>
		<li>Mergulhe as lamínulas em uma solução estéril de gelatina a 1%, escorra e seque à temperatura ambiente (TR).</li>
		<li>Coloque cada tampa em cada poço de uma placa de 6 poços e irradie as placas com luz UV por 15 min.</li>
		<li>Semeando uma gota contendo 25 x 103 células no centro do poço, aguardar 1 min e adicionar 1 mL de meio DMEM suplementado. Incubar durante 96 h a 37 °C e 5% CO2.</li>
		<li>Retire o meio e realize três lavagens com 1x PBS-AA usando uma pipeta de transferência.</li>
		<li>Adicione 1 mL de formalina neutra a 3,5% em cada poço e incube por 1 h no TR. Retire cuidadosamente a formalina e adicione 1 mL de etanol 70% frio a cada poço.</li>
		<li>Sele a placa com parafilme até o uso, para evitar o ressecamento. NOTA: A morfologia celular das ASCs também é avaliada pela coloração de hematoxilina-eosina durante diferentes passagens.</li>
		<li>Retire o etanol 70% de cada poço e hidrate as células por 5 min com água destilada. Enquanto isso, filtre as soluções de coloração.</li>
		<li>Remover a água e manchar as células sob agitação lenta por 15 min com solução de hematoxilina de Harris.</li>
		<li>Retire a solução corante e realize duas lavagens com 1x PBS.</li>
		<li>Manchar as células com solução de eosina sob agitação lenta por 1 min. Em seguida, retire a solução e realize duas lavagens com 1x PBS.</li>
		<li>Remova cuidadosamente as lamínulas de cada poço e monte as lâminas em uma gota de solução de montagem PBS-glicerol (1:1 v/v).</li>
		<li>Coloque uma linha de verniz de unha ao redor da lamínula e observe as lâminas histológicas sob o microscópio de luz.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Marcadores de expressão de ASCs por imunofluorescência
<ol><li>Prepare o tampão de lavagem contendo 1x PBS-0,05% Tween 20. Realizar as lavagens em RT e com agitação lenta. Lavar as placas três vezes com 2 mL de tampão/poço (incubar por 3 min para cada lavagem).</li>
	<li>Colocar 1 mL de reagente bloqueador (1:10) e incubar com agitação lenta por 20 min.</li>
	<li>Adicionar 200 μL (diluição 1:50) dos seguintes anticorpos primários a cada poço: CD9 (camundongo monoclonal), CD34 (coelho policlonal) e anti-CD63 (cabra policlonal). Incubar durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Lavar novamente as placas três vezes e incubar com 200 μL (diluição 1:50) dos seguintes anticorpos secundários: cabra conjugada IgG FITC anti rato, IgG IgG DyeLight 550 anticabra e IgG Cy3 anti-coelho de cabra.</li>
	<li>Lavar três vezes com 1x PBS-0,05% Tween 20 e contra-corar os núcleos celulares com 100 μL de DRAQ-7 (diluição: 17 μL em 1 mL de água bidestilada) por 20 min.</li>
	<li>Lave mais três vezes e monte as lâminas de acordo com os passos 4.1.12-4.1.13. Conservar as amostras protegidas da luz e congeladas até à utilização.</li>
	<li>Visualize as amostras sob microscopia confocal de epifluorescência utilizando as configurações e softwares adequados recomendados para este equipamento.</li>
</ol>6. Marcadores de expressão de CTAs por citometria de fluxo
<ol><li>Ajustar uma suspensão de célula única de células tripsinizadas ou descongeladas (subpassagens 3 ou 4) a uma concentração de 1 x 106 células/mL de 1x PBS-5% FBS. Alíquota 100 μL com 100.000 células em tubos centrífugos de 1,5 mL. Use uma alíquota sem etiquetagem para o controle de autofluorescência.</li>
	<li>Adicione ao repouso todas as quantidades adequadas de Anti-CD105 AF-594 e Anti-CD31 AF-680, de acordo com as instruções do fabricante. Incubar no escuro durante 20 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Lavar o excesso de coloração com 1 mL de 1x PBS-5% FBS por centrifugação a 250 x g por 5 min e suspender em 300 μL de formalina a 1%.</li>
	<li>Realizar a aquisição da amostra em citômetro de fluxo. A estratégia de gating das células é baseada em FSC-A vs. SSC-A gating, células únicas fechadas usando SSC-H vs. SSC-A seguido por FSC-A vs. FSC-H.</li>
	<li>Use o detector Y610-mCherry-A para CD105 AF-594 e o detector R660-APC-A para CD31 AF-680.</li>
</ol>7. Diferenciação das CTAs para a linhagem adipogênica
<ol><li>Em uma placa de 6 poços, semeie 1 x 10 4 células (P-4) por cm 2 e incube a 37 °C, 5% CO2, até 60-80% de confluência (~72-96 h). Induzir diferenciação, aplicando diretamente ao meio de cultura: 4 μM de insulina, 1 μM de 21-acetato de dexametasona (Dxa) e 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (MIX). Troque o meio de diferenciação a cada 2-3 dias.</li>
	<li>Preparar uma solução-mãe de 800 μM de insulina em 2 ml de água ultrapura estéril (adicionar 20 μL de HCl 1 N para garantir a dissolução completa) e conservar a -20 °C. Adicionar 10 μL de estoque de insulina, previamente diluído 1:100, e aplicar 10 μL em um volume final de 2 mL por poço.</li>
	<li>Preparar uma solução-mãe de 1 mM Dxa em 5 ml de água ultrapura estéril (note que não ocorre dissolução total). Conservar a 4 °C. Adicionar 40 μL/poço de uma diluição 1:4 do caldo de Dxa.</li>
	<li>Preparar um estoque de 100 mM de MIX em 2,5 mL de NaOH 0,1 N, vórtice, e adicionar 40 μL de NaOH 1 N para dissolução completa. Conservar a -70 °C. Adicionar 10 μL/poço de caldo MIX.</li>
	<li>Filtrar as soluções-mãe através de um filtro de seringa estéril de 0,22 μm antes do armazenamento.</li>
	<li>No dia 12, lavar as células três vezes com 1x PBS e incubar com 500 μL de formalina a 4% por 1 h em RT. Lave cada poço duas vezes com água destilada seguida, com isopropanol a 60% por 5 min e deixe secar.</li>
	<li>Adicionar 0,5% de óleo vermelho O diluído em isopropanol a 60% (500 μL/poço) e incubar por 20 min em TR. Lavar com 1 mL de água destilada três vezes e observar em microscópio invertido. NOTA: Para reagentes, equipamentos e materiais necessários, consulte a Tabela de Materiais.</li>
</ol>

Isolamento e caracterização de células-tronco derivadas do tecido adiposo

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<li>Yu, B., Zhang, X., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+from+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived from mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).</li>
<li>Maumus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+human+adipose+stromal+cells%3A+localization%2C+morphology%2C+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype.</a> International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).</li>
<li>Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+primary+isolation+and+culture+of+adipose-derived+stem+cells+and+their+phenotypic+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Alexandria+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile.</a> Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).</li>
<li>He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mesenchymal+stem+cells+from+rat+bone+marrow+and+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue.</a> Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Nas últimas quatro décadas, desde a descoberta das CTMs, vários grupos de pesquisadores descreveram procedimentos para a obtenção de CTMs de diferentes tecidos e espécies. Uma das vantagens do uso de ratos como modelo animal é a sua fácil manutenção e rápido desenvolvimento, bem como a facilidade de obtenção de CTMs a partir do tecido adiposo. Diferentes fontes teciduais têm sido descritas para a obtenção de CTAs, como gordura visceral, perirrenal, epididimal e subcutânea12,13,14,15,16....

As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm forte impacto na medicina regenerativa devido à sua alta capacidade de auto-renovação, proliferação, migração e diferenciação em diferentes linhagens celulares 1,2. Atualmente, uma grande quantidade de pesquisas está se concentrando em seu potencial para o tratamento e diagnóstico de várias doenças.
Existem diferentes fontes de células mesenquimais: medula óssea, músculo esquelético, líquido amniótico, folículos pilosos, placenta, tecido adiposo, entre outros. São obtidos de diferentes espécies, incluindo humanos, camundongos, ratos, cães e cavalos3. As CTMs derivadas da medula óssea (CTMs) têm sido utilizadas há muitos anos como uma importante fonte de células-tronco na medicina regenerativa e como uma alternativa ao uso de células-tronco embrionárias4. Entretanto, as CTMs derivadas do tecido adiposo, ou células-tronco derivadas do tecido adiposo (CTAs), são uma alternativa importante com grandes vantagens devido à facilidade de coleta e isolamento, bem como ao rendimento de células obtidas por grama de tecido adiposo 5,6. Tem sido relatado que a taxa de colheita de CTAs é geralmente maior do que a deCTMs 7. Foi inicialmente proposto que a capacidade reparadora/regenerativa das CTAs era devida à sua capacidade de se diferenciar em outras linhagens celulares8. No entanto, pesquisas nos últimos anos têm reforçado o papel primário dos fatores parácrinos liberados pelas CTAs em seu potencialreparador9,10.
O tecido adiposo (TA), além de ser uma reserva energética, interage com os sistemas endócrino, nervoso e cardiovascular. Também está envolvida no crescimento e desenvolvimento pós-natal, na manutenção da homeostase tecidual, reparo tecidual e regeneração. O TA é composto por adipócitos, células musculares lisas vasculares, células endoteliais, fibroblastos, monócitos, macrófagos, linfócitos, pré-adipócitos e ASCs. Estes últimos possuem importante papel na medicina regenerativa devido à sua baixa imunogenicidade11,12. As CTAs podem ser obtidas por digestão enzimática e processamento mecânico ou por explantes de tecido adiposo. As culturas primárias de ASCs são fáceis de manter, cultivar e expandir. A caracterização fenotípica das CTAs é essencial para verificar a identidade das células, avaliando a expressão de marcadores específicos de membrana por meio de métodos como imunofluorescência e citometria defluxo13. A International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) e a International Society for Cellular Therapy (ISCT) definiram que as CTAs expressam CD73, CD90 e CD105, enquanto não expressam CD11b, CD14, CD19, CD45 e HLA-DR14. Esses marcadores, tanto positivos quanto negativos, são, portanto, considerados confiáveis para a caracterização das CTAs.
Este projeto teve como foco descrever um procedimento para o isolamento e identificação de células mesenquimais adultas extraídas da TA de ratos, uma vez que esta fonte de células não apresenta desafios éticos, ao contrário das células-tronco embrionárias. Isso solidifica o procedimento como uma opção viável devido à facilidade de acesso e método minimamente invasivo em comparação com células-tronco derivadas da medula óssea. 
As células mesenquimais dessa fonte de tecido têm um papel importante na medicina regenerativa devido à sua capacidade imunomoduladora e baixa rejeição imunológica. Portanto, o presente estudo é parte fundamental de futuras pesquisas sobre seu secretoma e sua aplicação como terapia regenerativa em diferentes doenças, incluindo doenças metabólicas como o diabetes.

<table><tbody><tr><td>Anfotericina B</td><td>HyClone</td><td>SV30078.01</td><td></td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>Sartorius</td><td>AX224</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD9 (C-4)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-13118</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD34 (C-18)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-7045</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-C63</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-5275</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Endoglina/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 </td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-18838A594</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-18916AF680</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Cabra anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 </td><td>Novus</td><td>NB 120-6939</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Burro anti-cabra IgG (H+L) DyLight 550 </td><td>Invitrogen</td><td>SA5-10087</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-rato IgG FITC conjugado cabra F (ab&agudo;)</td><td>Sistemas RD.</td><td>Nº F103B</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Superior de Garrafa Estéril</td><td>Frascos</td><td>de Cultura de Células</td> e Tecidos de 10718003 <td></td></tr><tr><td></td><td>CORNING BIOFIL</td><td>170718-312B</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Hemacitômetro de Linha Brilhante com lâminas de câmara de contagem de células</td><td>SIGMA Aldrich </td><td></td> Z359629 <td></td></tr><tr><td>Poços de células: 6 poços</td><td></td><td></td> com tampa CORNING 25810 <td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de centrífuga</td><td>HeTTICH</td><td>ROTANA460R</td><td></td></tr><tr><td>Tubos eppendorf Centrifuge</td><td>Fischer Scientific</td><td>M0018242_44797</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV </td><td>Worthington</td><td>LS004186</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>SPL Life Science</td><td>43112</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura</td><td>Greiner Bio-One </td><td>191180</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert 2.0</td><td>Beckman Coulter</td><td>Versão</td><td></td> gratuita</tr><tr><td>Citômetro CytoFlex LX</td><td>Beckman Coulter</td><td>FLOW-2463VID03.17</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA Aldrich</td><td> 67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>DraQ7 Corante</td><td>Thermo Sc. </td><td>D15106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Eosin amarelado</td><td>Hycel</td><td>300</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td> <td>Baker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon 15 mL</td><td>Greiner Bio-One </td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon 50 mL</td><td>Greiner Bio-One </td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino </td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>128111163</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>GIBCO</td><td>15750045</td><td></td></tr><tr><td>Glicerina-Alta Pureza</td><td>Herschi Trading </td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>AMRESCO </td><td>0701-25G</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 Incubadora </td><td>Thermo Sc.</td><td></td><td></td>50116047</tr><tr><td>Ketamin Pet (Cetamina clorhidrate)</td> <td>Aranda</td><td>SV057430</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina </td><td>GIBCO / Thermo Sc. </td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LSM software Zen 2009 V5.5</td><td></td><td>Versão</td><td></td>gratuita</tr><tr><td>Gabinete de Segurança Biológica Classe II</td><td>NuAire</td><td>12082100801</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio epifluorescente </td><td>Zeiss Axiovert 100M</td><td>21.0028.001</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido </td><td>Olympus CK40</td><td>CK40-G100 </td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais 100X</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos 2 mL </td><td>Sarstedt </td><td>72695400</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos 1,5 mL</td><td>Sarstedt </td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas 0,2-2 &mu; L</td><td>Finnpipette</td><td>E97743</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas 2-20 &mu; L</td><td>Finnpipette</td><td>F54167</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas 20-200 &mu; L</td><td>Finnpipette</td><td>G32419</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas 100-1000 &mu; L</td><td>Finnpipette</td><td>FJ39895</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de nitrogênio líquido</td><td>Taylor-Wharton</td><td>681-021-06</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>SLBC3029V</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina </td><td>GIBCO / Thermo Sc. </td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Placa de Petri Cultura de células</td><td>CORNING Inc</td><td>480167</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta</td><td>Axygen Scientific</td><td>301-03-201</td><td></td></tr><tr><td>Pisabental (pentobarbital sódico)</td> <td>PISA Agropecuária</td><td>Q-7833-215</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio </td><td>J.T.Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>J.T Baker</td><td>2139900</td><td></td></tr><tr><td>S1 Enchimentos de pipeta</td><td>Thermo Sc</td><td>9531</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica 5 mL</td><td>PYREX</td><td>L010005</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica 10 mL</td><td>PYREX</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>J.T Baker</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio </td><td>J.T.Baker</td><td>15368426</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico anidro</td><td>J.T Baker</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>GIBCO BRL</td><td>11840-048</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Filtro Estéril</td><td>CORNING</td><td>431222</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>PerkinElmer Lambda 25</td><td>L6020060</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placas tituladoras</td><td>LAB-LINE</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Samco/Thermo Sc</td><td>728NL</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue mancha</td><td>GIBCO</td><td>1198566</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina Do Pâncreas Suíno</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>102H0234</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Bloqueio Universal 10x</td><td>BioGenex</td><td>HK085-GP</td><td></td></tr><tr><td>Xilapet 2% (cloridrato de xilazina)</td><td>Pet' s Pharma</td><td>Q-7972-025</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e identificação de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de ratos sprague dawley

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

As células mesenquimais adultas revolucionaram a biologia molecular e celular nas últimas décadas. Podem diferenciar-se em diferentes tipos celulares especializados, além de sua grande capacidade de auto-renovação, migração e proliferação. O tecido adiposo é uma das fontes menos invasivas e mais acessíveis de células mesenquimais. Também tem sido relatado para ter rendimentos mais elevados em comparação com outras fontes, bem como propriedades imunomoduladoras superiores. Recentemente, diferentes procedimentos para obtenção de células mesenquimais adultas de diferentes fontes teciduais e espécies animais têm sido publicados. Após avaliação dos critérios de alguns autores, padronizamos uma metodologia aplicável a diferentes propósitos e facilmente reprodutível. Um pool de fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo perirrenal e epididimal nos permitiu desenvolver culturas primárias com morfologia e funcionalidade ideais. As células foram observadas aderidas à superfície plástica por 24 h e exibiram morfologia semelhante a fibroblastos, com prolongamentos e tendência a formar colônias. As técnicas de citometria de fluxo (CF) e imunofluorescência (IF) foram utilizadas para avaliar a expressão dos marcadores de membrana CD105, CD9, CD63, CD31 e CD34. A capacidade das células-tronco derivadas do tecido adiposo (CTAs) de se diferenciar na linhagem adipogênica também foi avaliada usando um coquetel de fatores (4 μM de insulina, 0,5 mM de 3-metil-iso-butil-xantina e 1 μM de dexametasona). Após 48 h, observou-se perda gradual da morfologia fibroblastóide e, aos 12 dias, confirmou-se a presença de gotículas lipídicas positivas para coloração vermelho oleoso. Em resumo, propõe-se um procedimento para obtenção de culturas de ASC ótimas e funcionais para aplicação em medicina regenerativa.

O tecido adiposo foi obtido de ratos adultos da raça Sprague Dawley, com idade entre 3 e 4 meses de idade e peso corporal de 401 ± 41 g (média geométrica ± DP). O valor médio de 3,8 g de tecido adiposo epididimal e perirrenal correspondeu à análise de 15 extrações experimentais. Após 24 h de cultivo, as populações celulares permaneceram aderidas à superfície plástica e exibiram morfologia heterogênea. A primeira passagem foi realizada aos 8 ± 2 dias, com rendimento de 1,4 ± 0,6 x10,6 células em um total de oit...

Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

As células-tronco mesenquimais têm um papel muito amplo na comunicação celular devido à sua função parácrina. Este protocolo obtém células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo com funcionalidade morfológica, imunofenotípica e adequada para uso no estudo de terapias para regeneração pancreática e diabetes. Tem havido um aumento do uso de terapias celulares no tratamento do diabetes.Essas terapias incluem transplantes alogênicos de células pancreáticas, produtos derivados de células-tronco autólogas de células produtoras de insulina e tecido pancreático impresso em 3D usando tintas biológicas. A maioria das pesquisas estudou principalmente os componentes do secretoma e o papel na regulação de diferentes processos celulares. Novas técnicas como microarrays e sequenciamento de próxima geração podem investigar a função de miRNAs.Um desafio nessa área é conseguir maior estimulação das células mesenquimais, atingindo uma composição molecular precisa no secretoma e direcionando-o para o tratamento de uma condição específica. Estaremos avaliando como os miRNAs contribuem para a degeneração do tecido pancreático exposto ao estresse oxidativo. O estudo envolverá o uso de células-tronco do tecido adiposo.

isolation-identification-mesenchymal-stem-cells-derived-from-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células-tronco derivadas do tecido adiposo do arco periaórtico murino marcadas com fluorescência (ADSCs) do tecido adiposo do arco periaórtico murino. Após o isolamento, os NCADSCs são detectados, classificados usando classificação de células ativadas por fluorescência e, posteriormente, cultivados em uma placa, promovendo a proliferação celular.

Isolando células-tronco derivadas de tecido adiposo do tecido adiposo periaórtico murino

Este protocolo descreve uma técnica de isolamento para a obtenção de células do estroma mesenquimal residentes primários de pulmão de ratos, através do uso de digestão enzimática, separação por gradiente de densidade, e aderência ao plástico CD146 + selecção esférulas magnéticas.

Isolamento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Células Residente Lung estromais mesenquimais de rato Pulmões

Este protocolo descreve o isolamento de células-tronco derivadas do tecido adiposo de porco (pADSC) de tecidos adiposos subcutâneos com exame de multipotência. O pADSC multipotente é usado para delinear processos de diferenciação de adipócitos e estudar a transdiferenciação em múltiplas linhagens celulares de mesênquima mesodérmico ou outras linhagens de ectoderma e endoderme para estudos regenerativos.

Isolamento e diferenciação de células tronco derivadas de tecido adiposo de Suínos Subcutânea tecidos adiposos

Este protocolo fornece um método livre de enzimas para isolar as células-tronco mesenquímicas de abdominoplastia e amostras lipoaspirate usando um método explant. A ausência de enzimas duras ou etapas de centrífuga fornece células-tronco clinicamente relevantes que podem ser usadas para estudos in vitro ou transferidas de volta para a clínica.

Um método sem enzimas para isolamento e expansão de células-tronco mesenchymal derivadas do adiposo humano

Neste artigo, descrevemos o isolamento de células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs) derivadas de macacos rhesus usando um protocolo de digestão de tecido enzimático. Em seguida, descrevemos a proliferação de ADSC, que inclui descolamento, contagem e chapeamento celular. Por fim, a diferenciação do ADSC é descrita usando agentes indutores adipogênicos específicos. Além disso, descrevemos técnicas de coloração para confirmar a diferenciação.

Isolamento, Proliferação e Diferenciação de Células-Tronco Derivadas de Adiposos de Macacos Rhesus

Células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (Ad-MSCs) podem ser uma fonte potencial de MSCs que se diferenciam em células produtoras de insulina (IPCs). Neste protocolo, fornecemos passos detalhados para o isolamento e caracterização de Ad-MSCs epidímicas de ratos, seguidos de um protocolo simples e curto para a geração de IPCs a partir dos mesmos Ad-MSCs de ratos.

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo de rato para diferenciação em células produtoras de insulina

O tecido adiposo é uma excelente fonte de células-tronco mesenquimais. Aqui, trazemos a extração, cultivo e caracterização passo a passo de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) do tecido adiposo epididimal de camundongos suíços.

Isolamento, expansão in vitro e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos

Aqui, apresentamos um método padrão para isolar eficientemente células-tronco e adipócitos derivados do adiposo, caracterizado por redução de &gt;90% no tempo de processamento, alta viabilidade celular e ampla compatibilidade.

Isolamento Eficiente de Células-Tronco e Adipócitos Derivados do Adiposo a partir do Tecido Adiposo Suíno

Este protocolo descreve o isolamento ea subsequente expansão de células mesenquimais estromais e as células endoteliais que formam colônias sem o uso de animais soro autólogo para gerar pares para fins de transplante experimental.

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

Rat CTMs foram isoladas do fémur ea tíbia e então enriquecida por separação de células magnéticas. Células classificadas foram confirmados para a expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo. Estas células também foram cultivadas na densidade clonal para formar colônias individuais e, em seguida essas colônias foram separados por cilindros de clonagem.

Isolamento e Enriquecimento de células-tronco mesenquimais Rat (MSC) e Separação de-colônia Único Derivado MSCs

Aprenda a isolar células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley para terapias de regeneração pancreática e tratamento do diabetes. Este método auxilia pesquisadores na medicina regenerativa.

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

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