Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

Olá, sou Kara Ted, sou Leo. Vá comigo. E eu sou Simon McQueen Mason.

A digestibilidade da biomassa vegetal é um tema de grande interesse na atualidade. Isso ocorre porque há muitos açúcares ligados aos polissacarídeos das paredes celulares das plantas que compõem essa biomassa e, se pudermos retirar esses açúcares na forma utilizável, podemos fermentá-los para produzir todos os tipos de produtos, como combustíveis e produtos químicos. Infelizmente, esses materiais são extremamente difíceis de digerir e obter uma melhor compreensão do que controla essa digestibilidade é uma questão de alguma urgência.

Portanto, para poder usar material vegetal para a produção de grupo de renovação, precisamos ser capazes de medir o potencial de ificação nessas plantas. Então, aqui na Universidade de York, estamos examinando grandes populações de material vegetal para determinar seu potencial de ficação. Ficação é o processo de quebrar carboidratos complexos em seus componentes monossacarídeos para produzir produtos químicos valiosos por meio de diferentes processos industriais.

Para medir o potencial de ficação, reproduzimos processos industriais em microescala onde submetemos a biomassa a um pré-tratamento e hidrólise enzimática para determinar os açúcares liberados. Isso identifica variedades interessantes em genótipos. O sistema de alto rendimento funciona em um formato de placa de seis poços IG.

Condições suaves de hidrólise são usadas para expor diferenças sutis entre os genótipos, e também é flexível o suficiente para suportar diferentes materiais de substrato, bem como para avaliar diferentes enzimas. O método que usamos envolve a formatação do material vegetal como um pó, que é então pré-tratado com um ácido diluído ou alcalino a 90 graus por 20 minutos. Em seguida, uma digestão enzimática é realizada usando uma mistura comercial de celulase a 50 graus por oito horas.

Finalmente, um método MBTH é usado para determinar a liberação de açúcares redutores. O material vegetal é colhido como caules secos, que são cortados em segmentos de quatro milímetros. Estes são colocados em dois frascos de mililitros junto com três bolas de metal de cinco milímetros.

Os frascos são rotulados individualmente com códigos de barras, que são digitalizados para garantir a rastreabilidade das amostras. As amostras são carregadas nos robôs de moagem e formatação nos robôs. As amostras são moídas automaticamente e misturadas para permitir a distribuição da biomassa em uma placa de 96 poços.

Os frascos são perfurados e, em seguida, o frasco é reposicionado no braço robótico para que fique dentro de um funil que vibra para dispensar o pó. A vibração do funil é regulada por uma balança para atingir a quantidade alvo de massa por poço sendo dispensado. A biomassa é dispensada em 10 colunas das placas, deixando duas colunas para padrões.

Fazendo quatro repetições por amostra, carregamos 20 amostras por placa. O hidrolisado desta placa será triplicado em placas de PCR, resultando em três placas ópticas. Desta forma, temos três determinações de açúcares redutores por poço de biomassa.

Uma vez formatadas, as placas são seladas com um tapete de silicone para evitar a evaporação. Quando estão prontos, eles são movidos para o robô de manuseio de líquidos. No manuseio de líquidos, o pré-tratamento do robô, a hidrólise enzimática e a determinação dos açúcares liberados são feitos automaticamente.

A mesa de dois metros possui recipientes para os diferentes reagentes necessários, bem como espaço de armazenamento para os plásticos. Existem incubadoras para pré-tratamento e hidrólise, além de termocicladores para a determinação do açúcar. O pré-tratamento é feito na placa de poço profundo.

Adicionando soluções ácidas ou alcalinas diluídas ao pó de biomassa. As placas são transferidas para o bloco de aquecimento e incubadas a 90 graus por 20 minutos. Quando esta incubação é concluída, o pré-tratamento é removido enxaguando cinco vezes com tampão acetato de 500 microlitros.

Uma vez que o pré-tratamento é enxaguado, um coquetel de enzimas é adicionado. É uma mistura padrão. Ele contém celulose, uma novozima 1, 8 8 em uma proporção de quatro para um como uma concentração de sete FPU por poço.

As placas são incubadas por oito horas a 50 graus enquanto agitam. 75 microlitros do hidrolisado resultante são transferidos para uma placa de PCR. Nas colunas 11 e 12 das placas de PCR, os padrões de glicose são adicionados.

Em seguida, 25 microlitros de um molar de hidróxido de sódio são adicionados a todos os poços. Finalmente, 50 microlitros de reagente MBTH são pipetados na placa de PCR. A placa de poço profundo é armazenada após a conclusão da transferência do hidrolisado para a terceira placa de PCR.

Enquanto as placas de PCR são movidas para os termocicladores para incubação a 60 graus por 15 minutos. A etapa final do processo é a transferência da mistura de reação para placas ópticas para o desenvolvimento da cor. Após a incubação, as placas de PCR são removidas do termociclador.

Cem microlitros de reagente oxidante são adicionados à mistura de reação transferida. Para facilitar o desenvolvimento da cor, o processo de manuseio de líquidos é executado quatro vezes em 24 horas, onde o enxágue pré-tratamento, uma adição de enzima leva aproximadamente duas horas. A hidrólise enzimática leva oito horas e a determinação do açúcar leva mais duas horas.

Enquanto a primeira placa fica incubada por oito horas, a próxima placa inicia o processo. Com essa alocação de recursos robóticos, é possível obter três amostras de 80 por dia para determinar a quantidade de açúcares redutores liberados. As placas ópticas são classificadas em 620 nanômetros.

Os resultados obtidos são analisados para quantificar os açúcares liberados como nanomoles por miligrama por hora de reação. Então, obrigado por assistir, e espero que isso inspire sua pesquisa em biocombustíveis.