Name: Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprenda um método de sacarificação de alto rendimento para biomassa lignocelulósica usando hidrólise enzimática em placa de 96 poços. Esta abordagem automatizada permite analisar 80 amostras por dia para produção de biocombustíveis.

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Os autores gostariam de agradecer A Viksø-Nielsen (Novozymes) para o dom das enzimas celulolíticas. Este trabalho foi financiado pelo FP7 RENOVAÇÃO e por projetos BBSRC BB/G016178 e BB/G016194.

1. Preparação das amostras Nós normalmente trabalham com hastes de qualquer herbáceas ou plantas lenhosas. No caso de materiais de herbáceas que crescem as plantas até o vencimento, e após o desenvolvimento da semente que coletamos hastes seco uma vez a senescência está completa. As hastes são cortadas em quatro segmentos mm e colocadas em 2 frascos ml com três bolas de moagem. No caso de materiais lenhosos, as amostras são moídas para serragem grossa de madeira com um arquivo do curso e, em seguida, colocada em um moinho de bolas para processamento posterior. As amostras são colocadas em um rack dentro da moagem / formatação estação (Figura 1). Esta estação seqüencialmente grinds, mixagens, e pesa cada amostra. O número de repetições necessárias por amostra é estabelecida pelo teste do material moído em uma série de experimentos preliminares em que a variabilidade intrínseca para um tamanho de partícula certo é determinada. Os 2 mL são perfurados na parte inferior e os materiais são dispensados ​​pela vibração do frasco sobre o bem selecionado. O braço oscilante é controlado por um feedback de equilíbrio que permite a distribuição exata do pó. O robô dispensa 4 mg / poço em uma análise standard e 4 repetições são necessários na maioria dos casos. Isto permite que 20 amostras de plantas / placa a ser analisado. 2. Pré-tratamento Depois que as amostras são formatados, as placas de 96 poços são processadas por um sistema automatizado líquido de manejo (Figura 2). Aqui, um pré-tratamento é realizado em leve os materiais vegetais, adicionando 350 mL de ácido ou soluções alcalinas e aquecimento da placa em um bloco adaptado. Para evitar evaporação durante a análise, os 96 pratos são bem selado com um mate silicone. A temperatura eo tempo de pré-tratamento pode ser modificado de acordo com os materiais em estudo. A temperatura máxima, no entanto, é de 100 ° C. Um procedimento alternativo para o teste pré-tratamentos mais duras é para pré-tratamento dos materiais fora de linha e eliminar o pretreatmet do processo. 3. Hidrólise <ol><li> Após os materiais são pré-tratados, o robô automaticamente remove a solução de pré-tratamento e lavagens, todos os poços, 5 vezes com 850 mL tampão acetato 25 mM. Os enxaguatórios são realizadas pela adição de tampão à solução de pré-tratamento e, posteriormente, removendo 50% do volume total depois de permitir que os sólidos na amostra para resolver. A altura da aspiração é fixado em metade da massa de líquido para evitar a aspiração de sólidos do fundo do poço, não há perda desprezível de sólidos usando essa abordagem. Após estas lavagens do pH no poço é de 4,5 eo material está pronto para a hidrólise enzimática. </li><li> Uma mistura de enzimas contendo uma solução de celulases e hemicelulases é adicionado pelo robô. Em cada poço, 850 mL da mistura de enzimas é dispensada ea placa é transferida para uma 50 ° C agitando incubadora. A hidrólise padrão é realizada por 8 h, mas desta vez pode ser adaptado para a finalidade do experimento. O carregamento da enzima padrão usado para gramíneas é de 7 FPU / g de material. </li></ol> 4. Detecção de açúcares redutores Determinação de açúcares redutores liberados após a hidrólise foi realizada utilizando uma versão modificada do 3-metil-2-benzothiazolinone zona hídrica método (MTBH) 3. MBTH foi selecionado como o método mais adequado, porque era mais fácil de automatizar e menos suscetível a interferência de tais compostos como proteínas. Nós modificamos este método altamente sensível para uso na plataforma robótica para que pudesse quantificar com precisão os açúcares nas concentrações presentes no hidrolisado de biomassa, com um volume final de 250 mL que é adequado para um padrão de 96 placa óptica bem. Todos os passos a seguir são executadas automaticamente e três determinações independentes dos açúcares redutores foram realizadas para cada reação sacarificação. <ol><li> 30 mL de hidrolisado foi retirado da placa de poço profundo e misturado com 45 mL de tampão acetato 25 mM de sódio em um contornou PCR placa de 96 poços. </li><li> 25 mL de NaOH 1N e 50 ul de uma solução contendo 0,43 mg / ml MBTH e 0,14 mg / ml DTT foram adicionados. </li><li> Após a mistura, a placa de PCR foi aquecida a 60 ° C por 20 min em um termociclador ou dispositivo similar que oferece exatamente a mesma quantidade de calor para todos os 96 poços. </li><li> A reação resultante foi transferido para uma placa óptica. </li><li> Adicionar 100 ul do reagente oxidante (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% de ácido sulfâmico e 0,1% HCl). Misture bem e deixe a desenvolver por pelo menos 1 h. </li><li> Cada chapa deve conter também as reações padrão de 50 nmol, 100 e 150 nmol de glicose nmol. As placas ópticas são lidas a 620 nm. </li></ol> 5. Resultados representativos: Exemplos de diferentes tipos de análises são apresentados na figura 3 e 4. Todos os resultados foram obtidos utilizando a plataforma automatizada. Figura 3 reapresenta o aumento de açúcares redutores liberados por 8 h de incubação poplar terreno com quantidades crescentes de enzimas celulolíticas. A Figura 4 apresenta os efeitos do ácido e pré-tratamento alcalino em amostras de álamo. O pré-tratamento NaOH é mais eficiente que o pré-tratamento H2SO4 diluído em facilitar a liberação de açúcares durante a hidrólise. A quantidade de açúcares medidos após hidrólise diminui quando o pré-tratamento é realizado com concentrações superiores a NaOH 1M. <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Estação Robotic para moer e 96 de formatação bem de biomassa <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Estação de tratamento de líquido para a análise de Alto Rendimento sacarificação <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Efeito de cargas enzima diferente sobre a libertação de equivalentes redutores de açúcar a partir de amostras de álamo <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Açúcares Efeito de diferentes pré-tratamentos na sacarificação de amostras de álamo. A. liberado após pretreament com diferentes porcentagens de H2SO4 a 90 ° C por 30 minutos. Açúcares B. liberado após pré-tratamentos NaOH à mesma temperatura e tempo do que o pré-tratamento ácido .

<ol><li>Carpita, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Biogenesis+of+the+Cell+Walls+of+Grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Physiol+Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses.</a> Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).</li>
<li>Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustainable+liquid+biofuels+from+biomass%3A+the+writing%27s+on+the+walls%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls.</a> New Phytol. 178, 473-485 (2008).</li>
<li>Anthon, G. E., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+reducing+sugars+with+3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.</a> Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).</li>
<li>Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+saccharification+assay+for+determination+of+digestibility+in+plant+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials.</a> Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).</li>
</ol>

Variações do protocolo padrão de sacarificação podem ser utilizadas na mesma plataforma para determinar a atividade de enzimas celulolíticas (ou seja, pela variação das concentrações de enzima utilizadas em uma placa, bem como pelo uso de papel como substrato); comparação da eficiência de várias misturas enzimáticas sobre um material específico; curso temporal da sacarificação; etc.
Um protocolo padrão de sacarificação para comparar o potencial de sacarificação em diferentes materiais vegetais envolve uma hidrólise de oito horas (Figuras 3 e 4). A maioria dos materiais vegetais analisados requer quatro repetições. Nessas condições, a plataforma pode processar 80 amostras/dia. Essa análise está sendo utilizada para triagem de grandes populações de cevada, milho e braquiópode, com o objetivo de estabelecer a variabilidade no potencial de sacarificação e os genes envolvidos na sua determinação4.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Moagem e pesagem robô </td><td> Labman Automação </td><td></td></tr><tr><td> 2 ml micro tubo com tampas </td><td> Sarstedt Ltd </td><td> 72,694 </td></tr><tr><td> 5 milímetros de aço inoxidável contas </td><td> Qiagen Ltd </td><td> 69989 </td></tr><tr><td> 1,2 ml Abgene quadrados bem pratos de armazenamento </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> TUL-050-050C </td></tr><tr><td> Whatman tampa esteira por 96 quadrados placas bem </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> 7704-0104 </td></tr><tr><td> Robot hanling líquido </td><td> Tecan Group Ltd. </td><td> Liberdade Evo 200 </td></tr><tr><td> O ácido sulfúrico </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> S/9231/PB17 </td></tr><tr><td> Hidróxido de sódio </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> BPE359-500 </td></tr><tr><td> Acetato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8750-500G </td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> A/0420/PB17 </td></tr><tr><td> Novozyme 188 </td><td> Novozyme </td><td> DCN00214 </td></tr><tr><td> Celluclast 1.5L </td><td> Novozyme </td><td> CCN03122 </td></tr><tr><td> 96 bem cheia placas PCR saia </td><td> Sarstedt Ltd </td><td> 72.1980.202 </td></tr><tr><td> D-Glicose </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> G/0450/53 </td></tr><tr><td> 3-Metil-2-hidrato de cloridrato de hidrazona benzothiazolinone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 129739-25G </td></tr><tr><td> DL-ditiotreitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9163-1G </td></tr><tr><td> Corning microplaca com 96 fundo bem plana </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> TKT-521-050H </td></tr><tr><td> De amônio sulfato de ferro dodeca (III) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1668-250G </td></tr><tr><td> O ácido sulfâmico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 242772-500G </td></tr><tr><td> Ácido clorídrico </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> 12462-0026 </td></tr></tbody></table>

alto rendimento assay sacarificação para materiais lignocelulósicos

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polissacarídeos que compõem a biomassa vegetal lignocelulósica pode ser dividido para produzir uma variedade de açúcares que posteriormente podem ser utilizados no estabelecimento de uma biorefinaria. Essas matérias-primas que constituem uma nova plataforma industrial, que seja sustentável e carbono neutro, para substituir a actual dependência de combustíveis fósseis. A recalcitrância à desconstrução observado em materiais lignocelulósicos é produzido por várias propriedades intrínsecas das paredes celulares das plantas. Celulose cristalina é incorporado na matriz de polissacarídeos, tais como xilanas e arabinoxilanos, e toda a estrutura é envolto pela fenólicos polímero da lignina, que também é difícil de digerir 1. A fim de melhorar a digestibilidade dos materiais vegetais precisamos descobrir os principais gargalos para a sacarificação das paredes das células e também mutante tela e populações reprodutoras para avaliar a variabilidade na sacarificação 2. Estas tarefas requerem uma abordagem de alto rendimento e aqui apresentamos uma plataforma analítica que pode realizar a análise sacarificação em um formato placa de 96 poços. Esta plataforma foi desenvolvida para permitir o rastreamento de digestibilidade da lignocelulose de grandes populações de espécies de plantas variadas. Nós temos reduzido os volumes de reação para pré-tratamento gentil, hidrólise enzimática parcial de açúcar e determinação, para permitir que um grande número de ser avaliado rapidamente em um sistema automatizado. Esta plataforma automatizada trabalha com quantidades de miligramas de biomassa, realizando moagem, sob condições controladas para reduzir os materiais vegetais a uma granulometria padronizada de forma reproduzível. Depois que as amostras são moídas, o robô automatizado dispensa a formatação quantidades especificadas e registradas de material nos poços correspondentes da placa de 96 poços profundos (Figura 1). Normalmente, nós dispensar o mesmo material em 4 poços de ter 4 repetições para análise. Uma vez que as placas são preenchidos com o material vegetal no layout desejado, eles são movidos manualmente para uma estação de manipulação de líquidos (Figura 2). Nesta estação as amostras são submetidas a um pré-tratamento leve com um ácido diluído ou alcalina e incubadas a temperaturas de até 90 ° C. A solução de pré-tratamento é posteriormente removida e as amostras são lavadas com tampão para devolvê-los a um pH adequado para a hidrólise. As amostras são então incubados com uma mistura de enzimas por um período de tempo variável, a 50 ° C. Uma alíquota é retirada do hidrolisado e os açúcares redutores são automaticamente determinados pelo método colorimétrico MBTH.

Um método simples e rápido para determinar o potencial de sacarificação de um grande número de amostras de biomassa vegetal é descrito. A plataforma automatizada para esta análise envolve a preparação da biomassa de plantas para análise em 96 placas bem e do desempenho posterior de hidrólise pré-tratamento e quantificação dos açúcares liberados.

Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

Os polissacarídeos que compõem a biomassa lignocelulósica vegetal podem ser decompostos para produzir uma gama de açúcares que, posteriormente, podem ser utilizados no estabelecimento de...

Olá, sou Kara Ted, sou Leo. Vamos lá. E sou Simon McQueen Mason.A digestibilidade da biomassa vegetal é um tema de grande interesse no momento atual. Isso porque há uma grande quantidade de açúcares presos nos polissacarídeos das paredes celulares vegetais que compõem essa biomassa, e se conseguirmos liberar esses açúcares de forma utilizável, poderemos fermentá-los para produzir todo tipo de produto, como combustíveis e produtos químicos. Infelizmente, esses materiais são extremamente difíceis de digerir, e obter uma melhor compreensão do que controla essa digestibilidade é uma questão de certa urgência.Para poder utilizar material vegetal na produção de grupos renováveis, precisamos ser capazes de medir o potencial de fificação nessas plantas. Aqui na Universidade de York, estamos analisando grandes populações de material vegetal para determinar seu potencial de fificação. Fificação é o processo de quebra de carboidratos complexos em seus componentes de monossacarídeos para produzir substâncias químicas valiosas por meio de diferentes processos industriais.Para medir o potencial de sacarificação, reproduzimos processos industriais em escala microscópica, submetendo a biomassa a um pré-tratamento e à hidrólise enzimática para determinar os açúcares liberados. Isso identifica variedades interessantes em genótipos. O sistema de alto rendimento funciona em formato de placa de seis poços IG.Condições brandas de hidrólise são utilizadas para expor diferenças sutis entre genótipos, sendo também suficientemente flexíveis para suportar diferentes materiais de substrato, bem como para avaliar diferentes enzimas. O método que utilizamos envolve a preparação do material vegetal na forma de pó, que é então pré-tratado com um ácido ou alcalino diluído a 90 graus por 20 minutos. Em seguida, realiza-se uma digestão enzimática utilizando uma mistura comercial de celulase a 50 graus por oito horas.Por fim, utiliza-se um método MBTH para determinar a liberação de açúcares redutores. O material vegetal é colhido na forma de hastes secas, que são cortadas em segmentos de quatro milímetros. Estes são colocados em frascos de dois mililitros juntamente com três esferas metálicas de cinco milímetros.Os frascos são individualmente rotulados com códigos de barras, que são escaneados para garantir a rastreabilidade das amostras. As amostras são carregadas nos robôs de moagem e formatação. As amostras são automaticamente moídas e misturadas para permitir a dispensação da biomassa em uma placa de 96 poços.Os frascos são perfurados e, em seguida, reposicionados no braço robótico de forma a ficarem assentados dentro de um funil que vibra para dispensar o pó. A vibração do funil é regulada por uma balança para atingir a quantidade alvo por massa em cada poço dispensado. A biomassa é dispensada em 10 colunas das placas, reservando duas colunas para os padrões.Ao realizar quatro repetições por amostra, carregamos 20 amostras por placa. O hidrolisado dessa placa será triplicado em placas de PCR, resultando em três placas ópticas. Dessa forma, obtemos três determinações de açúcares redutores por poço de biomassa.Uma vez formatadas, as placas são seladas com uma manta de silicone para evitar evaporação. Quando estão prontas, são transferidas para o robô de manipulação líquida. Na manipulação líquida, o pré-tratamento, a hidrólise enzimática e a determinação dos açúcares liberados são realizados automaticamente.A mesa de dois metros possui recipientes para os diferentes reagentes necessários, bem como espaço de armazenamento para materiais plásticos. Há incubadoras para pré-tratamento e hidrólise, além de termocicladores para a determinação de açúcares. O pré-tratamento é realizado em placa de poços profundos.Adicionando soluções diluídas de ácido ou alcalinas ao pó de biomassa. As placas são transferidas para o bloco de aquecimento e incubadas a 90 graus por 20 minutos. Quando esta incubação for concluída, o pré-tratamento é removido mediante lavagem cinco vezes com 500 microlitros de tampão acetato.Após a lavagem do pré-tratamento, é adicionado um coquetel enzimático. É uma mistura padrão que contém celulase e novozym 1, 8 8 numa proporção de quatro para um, numa concentração de sete FPU por poço.As placas são incubadas por oito horas a 50 graus sob agitação. 75 microlitros do hidrolisado resultante são transferidos para uma placa de PCR. Nas colunas 11 e 12 das placas de PCR, são adicionados os padrões de glicose.A seguir, 25 microlitros de uma molar de hidróxido de sódio são adicionados a todas as cavidades. Finalmente, 50 microlitros do reagente MBTH são pipetados na placa de PCR. A placa de poços profundos é armazenada após a conclusão da transferência do hidrolisado para a terceira placa de PCR.Enquanto as placas de PCR são transferidas para os termocicladores e incubadas a 60 graus por 15 minutos. O passo final do processo é a transferência da mistura de reação para placas ópticas para o desenvolvimento da cor. Após a incubação, as placas de PCR são removidas do termociclador.Adiciona-se cem microlitros de reagente oxidante à mistura reacional transferida. Para facilitar o desenvolvimento da cor, o processo de manipulação líquida é realizado quatro vezes em 24 horas, no qual a lavagem de pré-tratamento e a adição da enzima levam aproximadamente duas horas. A hidrólise enzimática leva oito horas, e a determinação do açúcar leva mais duas horas.Enquanto a primeira placa é incubada por oito horas, a próxima placa inicia o processo. Com essa alocação de recursos robóticos, obtém-se um rendimento triplo de 80 amostras por dia para determinar a quantidade de açúcares redutores liberados. As placas ópticas são lidas a 620 nanômetros.Os resultados obtidos são analisados para quantificar os açúcares liberados em nanomoles por miligrama por hora de reação. Então, obrigado por assistir e espero que isso inspire sua pesquisa em biocombustíveis.

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Biologia

Biomassa vegetal é um recurso de carbono neutro principais renováveis, que poderiam ser usados ​​para a produção de biocombustíveis. Biomassa vegetal consiste principalmente das paredes das células, um material estruturalmente complexo composto chamado lignocelulose. Aqui nós descrevemos um protocolo para uma análise abrangente do conteúdo e composição dos carboidratos da parede derivadas.

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Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

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