Análise de Tronco de Migração da crista neural celular usando uma modificação Zigmond Ensaio Câmara

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a capacidade de uma molécula de provocar quimiotaxia e outras respostas migratórias em células da crista neural do tronco explantadas. Isso é feito isolando primeiro os tubos neurais no nível do tronco entre aproximadamente oito e 15 somitos de comprimento e cultivando cada um dos tubos neurais durante a noite em lamínulas revestidas de fibronectina separadas para permitir a emigração da crista neural. Em seguida, uma cultura de crista neural ideal é selecionada.

O tubo neural é removido da cultura e a lamínula contendo a cultura é montada em uma câmara de zigmund modificada de modo que a borda mais reta da cultura fique paralela ao vetor do gradiente molecular a ser aplicado em toda a cultura. O terceiro passo é gerar um gradiente molecular através da cultura e, em seguida, filmar a migração das células periféricas da crista neural ao longo da borda reta previamente selecionada da cultura. A etapa final é rastrear e analisar a migração das células da crista neural periférica posicionadas ao longo da borda selecionada da cultura usando o software Image J.

Em última análise, pode-se determinar se a molécula selecionada pode alterar a direcionalidade celular ou outras características migratórias, como velocidade, por meio da análise dos dados de trajetória celular obtidos. A principal vantagem desta técnica sobre as técnicas existentes, como o ensaio de câmara de Boyden, é que a um custo muito baixo. Este método pode ser usado para analisar a migração de células já polarizadas na periferia de culturas explanadas primárias usando imagens de lapso de tempo.

Depois de incubar os ovos de pintinhos por 56 horas a 38 graus Celsius, remova os ovos da incubadora, borrife-os levemente com etanol a 70% e deixe os ovos secarem enquanto secam. Encha uma placa de Petri de plástico estéril com solução de toque de pintinho e esterilize por UV uma bandeja de vidro. Encha uma placa de Petri de vidro de cinco centímetros com dis displays.

Agora abra os ovos na bandeja de vidro esterilizada UV. Extraia cada embrião de sua gema cortando primeiro as ilhas de sangue do embrião com uma tesoura curva. Em seguida, com uma pinça romba, pegue o embrião por sua membrana embrionária extra e coloque o embrião na placa de Petri preparada contendo anéis de ring.

Em seguida, selecione cerca de nove embriões que estão entre hambúrguer e Hamilton. Os estágios 15 a 17 com uma agulha de tungstênio cortam todos os tecidos embrionários anteriores ao ácaro 10 e removem todos os tecidos embrionários cordais a partir do quinto ácaro mais recém-formado. Em seguida, corte as membranas embrionárias extras a cerca de dois milímetros do embrião.

Coloque os troncos embrionários isolados em baias e incube-os por uma hora e 15 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono enquanto os troncos embrionários estão incubando. Prepare seis lamínulas para cultivo. Primeiro, enxaguando-os em etanol 70% e deixando-os secar.

Em seguida, usando um marcador de laboratório, desenhe um círculo no centro de cada lamínula com cerca de um centímetro de diâmetro para posterior identificação da camada de conexão de fibrina na mesma face de cada lamínula. Escreva uma palavra ou símbolo assimétrico fora do círculo desenhado para facilitar a identificação da parte superior e inferior da lamínula. Agora coloque cada lamínula em um prato estéril separado de 40 por 10 milímetros com o lado rotulado voltado para baixo e deixe o prato aberto sob uma lâmpada UV germicida por 10 minutos.

Em seguida, aplique 60 microlitros de fibronectina na superfície não marcada da lamínula dentro do círculo de um centímetro, certificando-se de que toda a área do círculo seja revestida. Coloque os pratos na incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após o período de incubação, aspirar cuidadosamente o final de cada lamínula.

Em seguida, adicione 250 microlitros de meio de cultura à área revestida com nin FI. A lamínula e, em seguida, incube as lamínulas novamente até que os tubos neurais tenham sido isolados. Enquanto as lamínulas estão incubando, encha uma placa de Petri de vidro de cinco centímetros com L 15 médio.

Agora transfira todos os troncos embrionários incubados para a placa de Petri preparada. Use uma pinça fina e uma língua afiada e agulha para dissecar o tubo neural, cortando cuidadosamente ao longo da borda do tubo neural e os somitos com a agulha. Remova as lamínulas da incubadora.

Selecione seis dos tubos neurais mais longos e retos e, em seguida, usando uma ponta de micropipeta preparada com meio de cultura, transfira um tubo neural para cada uma das seis lamínulas. Certifique-se de que cada tubo neural esteja dentro da área revestida com fibronectina de sua respectiva lamínula usando uma micropipeta e incube durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, coloque pelo menos dois mililitros de meio de cultura sem soro em um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros.

Deixe o bezerro ligeiramente desparafusado enquanto incuba o tubo durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir que o pH do meio se ajuste. Após a cultura durante a noite, selecione as três melhores culturas de células da crista neural que tenham pelo menos uma borda reta longa das três culturas. Escolha um para carregar a primeira câmara e devolva os outros à incubadora para uso posterior.

Em seguida, usando nosso cotonete, aplique uma camada fina e uniforme de vaselina nas áreas ao redor dos reservatórios e na ponte de uma câmara de sigmund modificada. Em seguida, com uma agulha de tungstênio, remova suavemente o tubo neural da lamínula contendo a cultura de células da crista neural selecionada, deixando as células da crista neural cercadas presas ao revestimento de fibronectina. Marque o prato com um marcador de laboratório para lembrar a orientação da borda mais reta da cultura de células da crista neural.

Em seguida, coloque algumas gotas do meio pré-incubado na ponte da câmara zigmund modificada. Em seguida, pegue a lamínula com uma pinça fina. Passe a borda da lamínula contra um lenço Kim para remover a maior parte do meio de cultura antigo e coloque imediatamente a lamínula na câmara de zigmund modificada de modo que a borda reta da célula da crista neural a ser filmada fique centralizada ao longo do comprimento da ponte e aproximadamente perpendicular à borda do reservatório da ponte.

Usando um microscópio invertido, mova a borda reta da célula da crista neural para o lado da ponte mais próximo do reservatório. Isso conterá o tato de quimioterapia suspeito e alinhará com mais precisão a borda reta da célula da crista neuro perpendicular à borda do reservatório da ponte. Agora, pressione a tampa com cuidado, mas com segurança, deslize para dentro da vaselina presente na câmara zigmund, certificando-se de que esteja completamente selada na câmara.

Em seguida, coloque vaselina adicional ao longo da borda da lamínula para garantir ainda mais que ela fique hermética. Ajuste o ângulo da borda da célula da crista neural novamente para corrigir qualquer movimento durante o processo de teto. Em seguida, carregue cerca de 300 microlitros de meio pré-incubado em uma seringa de um mililitro.

Com uma agulha anexada de 25 gauge por 1,5 polegada. Injete o meio no reservatório que não conterá nenhum tato de quimioterapia até ficar cheio. Tomando cuidado para não gerar bolhas no reservatório.

Em seguida, tampe o reservatório em ambos os lados com uma quantidade suficiente de vaselina antes de carregar o próximo reservatório. Agora carregue uma segunda seringa com 300 microlitros de meio pré-incubado contendo o tato de quimioterapia desejado. Em seguida, injete o meio no reservatório oposto da mesma maneira.

Novamente, selando cuidadosamente o reservatório com vaselina. Depois de incubar a câmara Sigmund carregada a 37 graus Celsius por uma hora antes das filmagens. Então, durante a incubação a aproximadamente 37 graus Celsius, a borda mais reta da cultura de células da crista neural por três horas em intervalos de 92 para controles, carregue as câmaras zigmund contendo cada uma das outras duas melhores culturas de células da crista neural, conforme mostrado.

Usando os tratamentos de controle apropriados para encher os reservatórios e preparar a ponte. Use o plug-in de rastreamento manual image J para rastrear a migração de células periféricas da crista neural ao longo da borda reta da cultura. Use o plugin da ferramenta de quimiotaxia e migração para analisar vários parâmetros das trajetórias migratórias obtidas.

As culturas de células da crista neural do tronco alongado foram preparadas por cultura noturna de tubos neurais e as culturas de células da crista neural resultantes com pelo menos uma borda reta longa foram selecionadas para experimentação. A borda reta mais longa de uma cultura selecionada foi então posicionada perpendicularmente à borda do reservatório da ponte e, portanto, paralela ao vetor do futuro gradiente aplicado. O reservatório que não continha o suspeito atrativo de quimioterapia representado aqui com um sinal de menos foi carregado primeiro e lacrado.

Em seguida, o outro reservatório foi carregado com o suspeito de atração de quimioterapia representado com um sinal de mais e as células da crista neural periférica seladas ao longo da borda previamente selecionada foram então fotografadas e rastreadas usando o plug-in de rastreamento manual para a imagem J. Numerosas características migratórias em resposta ao gradiente aplicado podem ser avaliadas com base nos dados de rastreamento obtidos conforme ilustrado neste gráfico. Por exemplo, um índice de quimiotaxia pode ser derivado dividindo o deslocamento de uma célula ao longo do eixo x pela distância total que ela migrou. A resposta atrativa de todas as células rastreadas é demonstrada pelo gráfico de trajetória celular mostrado aqui.

Cada trilha vermelha é a trajetória de uma célula que migrou em direção ao reservatório carregado com um suspeito de atração de quimioterapia. Nesta figura, há uma quantidade substancialmente maior de faixas vermelhas em comparação com as pretas. Em outro teste, foi validada a capacidade de uma câmara de sigmund modificada de manter um gradiente molecular.

Um conjugado Alexa Fluor 4 88 IGM foi adicionado ao reservatório esquerdo e a intensidade de fluorescência através da ponte foi medida em vários momentos. O gradiente permaneceu por pelo menos 26 horas Depois de assistir ao vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar a capacidade de uma molécula de provocar quimiotaxia e outros comportamentos migratórios em culturas de células da crista neural do tronco explantado usando um ensaio de câmara zigmund modificado.