Análise de Tronco de Migração da crista neural celular usando uma modificação Zigmond Ensaio Câmara

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a capacidade de uma molécula de induzir quimiotaxia e outras respostas migratórias em células de crista neural de tronco isoladas. Isso é realizado primeiramente isolando tubos neurais do nível de tronco com comprimento aproximado entre oito e 15 somitos e cultivando cada um dos tubos neurais durante a noite em lamínulas separadas recobertas com fibronectina, permitindo assim a emigração das células da crista neural. Em seguida, seleciona-se um cultivo ideal de crista neural.

O tubo neural é removido do cultivo e a lamínula contendo o cultivo é montada em uma câmara Zigmund modificada, de modo que a borda mais reta do cultivo fique paralela ao vetor do gradiente molecular a ser aplicado sobre o cultivo. O terceiro passo consiste em gerar um gradiente molecular através do cultivo e, em seguida, filmar a migração das células da crista neural periférica ao longo da borda reta previamente selecionada do cultivo. O passo final é rastrear e analisar a migração das células da crista neural periférica posicionadas ao longo da borda selecionada do cultivo, utilizando o software Image J.

Por fim, pode-se determinar se a molécula selecionada é capaz de alterar a direcionalidade celular ou outras características migratórias, como a velocidade, por meio da análise dos dados de trajetória celular obtidos. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o ensaio de câmara de Boyden, é que ela pode ser realizada a um custo muito baixo. Este método pode ser utilizado para analisar a migração de células já polarizadas na periferia de culturas primárias de explantes, utilizando imagens de tempo-lapse.

Após incubar ovos de galinha por 56 horas a 38 graus Celsius, retire os ovos do incubador, borrife-os levemente com etanol a 70% e, em seguida, deixe-os secar enquanto estiverem secando. Encha uma placa de Petri plástica estéril com solução de Ringer de galinha e esterilize por UV uma bandeja de vidro. Encha uma placa de Petri de vidro de cinco centímetros com exibições de dis.

Agora quebre os ovos e abra-os na bandeja de vidro esterilizada por UV. Extraia cada embrião de sua gema cortando primeiro ao redor das ilhas sanguíneas do embrião com tesoura curva. Em seguida, com pinça romba, segure o embrião pela sua membrana extraembrionária e coloque-o na placa de Petri preparada contendo ringer.

Em seguida, selecione cerca de nove embriões que estejam entre os estágios hambúrguer e Hamilton, de 15 a 17. Com uma agulha de tungstênio, corte todos os tecidos embrionários anteriores ao somito 10 e remova todos os tecidos embrionários cordais a partir de aproximadamente o quinto somito mais recentemente formado. Em seguida, retire as membranas extraembrionárias deixando cerca de dois milímetros de distância do embrião.

Coloque os troncos embrionários isolados nas baias de dissecação e incube-os por uma hora e 15 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono enquanto os troncos embrionários estão em incubação. Prepare seis lamínulas para cultivo. Primeiro, enxaguando-as em etanol 70% e deixando-as secar.

Em seguida, utilizando uma caneta de laboratório, desenhe um círculo no centro de cada lamínula com cerca de um centímetro de diâmetro para posterior identificação do revestimento de fibrina conectado na mesma face de cada lamínula. Escreva uma palavra ou símbolo assimétrico fora do círculo desenhado para facilitar a identificação da parte superior e inferior da lamínula. Agora, coloque cada lamínula em uma placa estéril separada de 40 por 10 milímetros, com o lado rotulado voltado para baixo, e deixe a placa aberta sob uma lâmpada germicida de UV por 10 minutos.

Em seguida, aplique 60 microlitros de fibronectina na superfície não marcada do lamínula dentro do círculo de um centímetro, certificando-se de que toda a área do círculo esteja revestida. Coloque as placas no incubador a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após o período de incubação, aspire cuidadosamente a fibronectina de cada lamínula.

Em seguida, adicione 250 microlitros de meio de cultura à área revestida com FI nin. A lamínula e, então, incube novamente as lamínulas até que os tubos neurais tenham sido isolados. Enquanto as lamínulas estão em incubação, preencha uma placa de Petri de vidro de cinco centímetros com meio L 15.

Agora transfira todos os troncos embrionários incubados para a placa de Petri preparada. Use pinças finas e uma agulha afiada para dissecar o tubo neural, cortando cuidadosamente ao longo da borda entre o tubo neural e os somitos com a agulha. Remova as lamínulas do incubador.

Selecione seis dos tubos neurais mais longos e retos e, em seguida, utilizando uma ponteira de micropipeta previamente preparada com meio de cultura, transfira um tubo neural para cada um dos seis lamínulas. Certifique-se de que cada tubo neural esteja dentro da área revestida com fibronectina do respectivo lamínula utilizando uma micropipeta e incube durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, coloque pelo menos dois mililitros de meio de cultura sem soro em um tubo cônico estéril de 15 mililitros.

Deixe a tampa ligeiramente solta enquanto incuba o tubo durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir que o pH do meio se ajuste. Após o cultivo noturno, selecione os três melhores cultivos de células da crista neural que apresentem pelo menos uma borda longa e reta dentre os três cultivos. Escolha um deles para carregar a primeira câmara e devolva os demais ao incubador para uso posterior.

Em seguida, utilizando nosso cotonete, aplique uma camada fina e uniforme de vaselina nas áreas ao redor dos reservatórios e da ponte de uma câmara Sigmund modificada. Depois, com uma agulha de tungstênio, remova suavemente o tubo neural da lamínula contendo o cultivo selecionado de células da crista neural, deixando as células da crista neural circundantes aderidas ao revestimento de fibronectina. Marque o recipiente com uma caneta de laboratório para lembrar a orientação da borda mais reta do cultivo de células da crista neural.

Em seguida, coloque algumas gotas do meio pré-incubado sobre a ponte da câmara de Zigmund modificada. Então, pegue a lamínula com pinça fina. Toque a borda da lamínula em um lenço de papel Kim para remover a maior parte do meio de cultura antigo e, imediatamente, posicione a lamínula sobre a câmara de Zigmund modificada, de modo que a borda reta das células da crista neural a ser filmada fique centralizada ao longo do comprimento da ponte e aproximadamente perpendicular à borda do reservatório da ponte.

Usando um microscópio invertido, mova a borda reta das células da crista neural para o lado da ponte mais próximo ao reservatório. Isso conterá o quimiotático suspeito e alinhará mais precisamente a borda reta das células da crista neural perpendicularmente à borda do reservatório da ponte. Agora, pressione cuidadosa mas firmemente a lamínula no gel de petróleo presente na câmara de Zigmond, certificando-se de que ela esteja completamente selada à câmara.

Em seguida, aplique vaselina adicional ao longo da borda da lamínula para garantir ainda mais que fique bem vedada. Ajuste novamente o ângulo da borda das células da crista neural para corrigir qualquer movimento ocorrido durante o processo de vedação. Em seguida, carregue aproximadamente 300 microlitros de meio pré-incubado em uma seringa de um mililitro.

Com uma agulha acoplada de 25 mm por 1,5 polegada. Injete o meio no reservatório que não conterá nenhum quimiotático até ficar cheio. Tendo o cuidado de não gerar bolhas no reservatório.

Em seguida, tampe o reservatório em ambos os lados com uma quantidade suficiente de vaselina antes de carregar o próximo reservatório. Agora, carregue uma segunda seringa com 300 microlitros de meio pré-incubado contendo o quimiotático desejado. Então, injete o meio no reservatório oposto da mesma maneira.

Novamente, vedando cuidadosamente o reservatório com vaselina. Após isso, incubar a câmara Sigmund carregada a 37 graus Celsius por uma hora antes da filmagem. Em seguida, durante a incubação a aproximadamente 37 graus Celsius, registrar a borda mais reta da cultura de células da crista neural por três horas em intervalos de 92 segundos; como controle, carregar câmaras Zigmund contendo cada uma das outras duas melhores culturas de células da crista neural conforme mostrado anteriormente.

Utilizando os tratamentos controle apropriados para preencher os reservatórios e escorificar a ponte. Use o plugin manual de rastreamento de imagem J para rastrear a migração de células da crista neural periférica ao longo da borda reta do cultivo. Use o plugin da ferramenta de quimiotaxia e migração para analisar vários parâmetros das trajetórias migratórias obtidas.

Culturas de células da crista neural do tronco alongadas foram preparadas por meio do cultivo noturno de tubos neurais, e as culturas resultantes de células da crista neural com pelo menos uma borda longa e reta foram selecionadas para experimentação. A borda reta mais longa de uma cultura selecionada foi então posicionada perpendicularmente à borda do reservatório da ponte, e, portanto, paralelamente ao vetor do gradiente aplicado posteriormente. O reservatório que não continha o quimioatraente suspeito, representado aqui com um sinal de menos, foi carregado primeiro e selado.

Em seguida, o outro reservatório foi carregado com o quimioatraente suspeito, representado por um sinal de adição, e células da crista neural periférica seladas ao longo da borda previamente selecionada foram então imagiadas e rastreadas utilizando o plugin de rastreamento manual do ImageJ. Diversas características migratórias em resposta ao gradiente aplicado podem ser avaliadas com base nos dados de rastreamento obtidos, conforme ilustrado neste gráfico. Por exemplo, um índice de quimiotaxia pode ser obtido dividindo o deslocamento da célula ao longo do eixo x pela distância total que ela migrou. A resposta atrativa de todas as células rastreadas é demonstrada pelo gráfico de trajetória celular mostrado aqui.

Cada trilha vermelha é a trajetória de uma célula que migrou em direção ao reservatório carregado com um quimioatraente suspeito. Nesta figura, há uma quantidade significativamente maior de trilhas vermelhas em comparação com as pretas. Em outro teste, validou-se a capacidade de uma câmara sigmund modificada de manter um gradiente molecular.

Um conjugado Alexa Fluor 488 IGM foi adicionado ao reservatório esquerdo e a intensidade da fluorescência ao longo da ponte foi medida em diversos momentos. O gradiente permaneceu por pelo menos 26 horas. Após assistir ao vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar a capacidade de uma molécula de induzir quimiotaxia e outros comportamentos migratórios em culturas de células do corno neural troncal explantadas, utilizando um ensaio modificado de câmara de Zigmond.