Fabricação de poços de Agarose personalizado para a propagação de células e tecido anel Self-assembly usando moldes 3D-impresso
2 de abril de 2018
Este protocolo descreve uma plataforma para a fabricação de anéis de tecido Self montado em tamanhos variáveis, usando um molde de plástico personalizado 3D-impresso. PDMS negativos são curados em molde 3D-impresso; Então a agarose é convertido nos negativos PDMS curados. As células são semeadas em poços de agarose resultante onde eles agregam em anéis de tecido.
O objetivo geral deste procedimento é criar moldes de semeadura de células personalizados que são usados para fazer anéis de tecido automontados de várias dimensões. Este método nos permite criar anéis de tecido tridimensionais a partir de células humanas que podem ser usados para avaliar a estrutura, força e função do tecido. A principal vantagem dessa técnica é que ela é um método simples para fabricar moldes para tecidos automontados com dimensões personalizadas.
Para iniciar o procedimento, use um software de design auxiliado por computador para criar um desenho de um molde nas dimensões desejadas. Envie o arquivo CAD para uma impressora 3D de alta resolução. Imprima o molde em um plástico com acabamento brilhante que seja estável a 50 graus Celsius.
Lave bem o molde impresso com pincel, detergente e água. Enxágue o molde com água destilada e deixe secar ao ar em uma gradinha. É importante escolher um plástico impresso em 3D que seja estável na temperatura de cura PDMS.
Resíduos que são transferidos para o PDMS durante o aquecimento podem afetar a formação do anel. Em seguida, meça 25 gramas de base PDMS em um barco de pesagem descartável. Adicione o agente de cura na proporção de 1:10 em peso e mexa vigorosamente até que a base e o agente de cura estejam bem misturados.
Em seguida, fixe fita de laboratório nas laterais do molde para formar uma parede de cerca de um centímetro de altura ao redor da face com os poços impressos. Certifique-se de que não haja lacunas na parede da fita. Despeje a mistura PDMS no molde impresso em 3D.
Desgaseifique o PDMS em uma câmara de vácuo por 30 a 60 minutos ou até que não haja bolhas. Cure o PDMS a 50 graus Celsius por duas a quatro horas ou até que o PDMS esteja suficientemente sólido para ser removido do molde. Em seguida, remova a fita e separe cuidadosamente o negativo PDMS do molde.
Incube o negativo PDMS em um forno a 60 graus Celsius por uma hora para garantir que esteja totalmente curado. Em seguida, lave bem o negativo com detergente e água. Enxágue o molde com água destilada e deixe secar ao ar.
Antes de fabricar o molde de agarose, autoclave o negativo PDMS, um par de pinças rombas e quaisquer outras ferramentas desejadas. Para iniciar a fabricação, prepare e autoclave pelo menos 50 mililitros de agarose a dois por cento em DMEM. Prepare poços de agarose um dia antes da semeadura do anel.
Pipete quatro mililitros de agarose derretida no negativo PDMS autoclavado, tomando cuidado para não encher demais o molde. Em seguida, pipete a agarose derretida nas cavidades para os postes do poço de agarose. Use a ponta da pipeta para remover todas as bolhas de ar.
A superfície final da agarose deve ser plana. Deixe a agarose esfriar por cerca de 10 minutos. Em seguida, use uma pinça romba para separar cuidadosamente o molde de agarose resfriado do negativo PDMS.
Coloque o molde voltado para cima em um poço de uma placa de seis poços. Adicione o meio de cultura completo apropriado ao poço da placa para que os poços de agarose fiquem completamente submersos. Equilibre os poços de agarose a 37 graus Celsius durante a noite antes de usar.
Primeiro, em uma placa de cultura de 15 centímetros, cultive células musculares lisas da aorta de ratos a 37 graus Celsius em uma atmosfera de dióxido de carbono a 5% até que 70% da confluência seja alcançada. Depois que o molde de agarose desejado for preparado e equilibrado durante a noite, lave o prato de cultura duas vezes com cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Depois de remover o PBS, adicione três mililitros de tripzin a 0,25% ao prato.
Incube a 37 graus Celsius por dois a três minutos ou até que as células tenham se levantado do prato. Neutralizar a tripzina com três mililitros do meio de cultura completo. Transfira as células para um tubo cônico e pipete suavemente as células até que estejam completamente ressuspensas.
Diluir um aliquat da suspensão celular com um volume igual de corante azul de tripano e contar as células com um hemocitômetro. Em seguida, centrifugue a suspensão a 200 vezes G durante cinco minutos. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura completo para atingir uma concentração de 10 milhões de células por mililitro.
As etapas mais importantes para garantir a formação consistente de anéis são otimizar o número de células e o meio de cultura para a linhagem celular que você está usando. Em seguida, obtenha os poços de agarose equilibrados. Aspire cuidadosamente todo o meio ao redor da parte externa da agarose e dentro dos poços de agarose, tomando cuidado para não perfurar o fundo dos poços.
Pipete 50 microlitros da suspensão celular em cada poço. Adicione dois mililitros de meio fresco ao redor da parte externa dos poços de agarose sem deixar o meio derramar nos poços. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius em uma atmosfera de cinco por cento de CO2 para permitir que as células se agreguem.
Em seguida, aspire o meio de fora da agarose. Adicione 4,5 mililitros de meio fresco ao poço do prato para que os poços de agarose sejam preenchidos e todo o molde de agarose fique completamente submerso. Continue incubando a placa até que os anéis de tecido estejam suficientemente desenvolvidos, substituindo o meio a cada dia.
Em seguida, deslize suavemente cada anel de tecido de seu poste usando uma pinça. Imediatamente, fixe os anéis para histologia ou use os anéis para avaliações funcionais ou mecânicas. A impressão 3D permitiu um design de molde mais flexível.
Os diâmetros dos postes eram facilmente variados, como mostrado em meus anéis de células musculares lisas de rato fabricados em torno de postes com diâmetros de dois, quatro e doze milímetros. Anéis de tecido também foram preparados a partir de SMCs humanas primárias, células-tronco mesenquimais humanas e SMCs derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas. Os anéis foram utilizados como modelos de tecidos in vitro para avaliações da função tecidual e resistência mecânica.
Embora esse método tenha sido originalmente projetado para fabricar e modelar tecido vascular, ele também pode ser usado para fabricar segmentos de outros tipos de tecido, como cartilagem, músculo esquelético e tecido cardíaco. Este método fornece uma maneira simples para os pesquisadores criarem moldes personalizados para fabricar anéis de tecido 3D com diferentes dimensões. Esses anéis podem ser usados para avaliar a estrutura, as propriedades mecânicas e a função de tecidos projetados feitos de diferentes tipos de células.
Visão Geral
Este protocolo descreve um método para criar anéis de tecido autoagregados de tamanhos variados utilizando um molde personalizado impresso em 3D. O processo envolve a fabricação de negativos de PDMS e a moldagem de agarose para criar poços para agregação celular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Engenharia de Tecidos
- Cultura Celular
- Impressão 3D
Contexto
- Anéis de tecido autoagregados podem ser usados para estudar a estrutura e a função tecidual.
- A impressão 3D permite designs personalizáveis de moldes.
- Essa técnica pode ser aplicada a diversos tipos de tecidos, incluindo tecidos vasculares e cardíacos.
- A otimização do número de células e das condições de cultivo é crucial para a formação bem-sucedida de anéis teciduais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método simples para fabricar anéis de tecido com dimensões específicas.
- Avaliar as propriedades mecânicas e a funcionalidade dos tecidos engenheirados.
- Fornecer uma plataforma para estudar diferentes tipos celulares na engenharia de tecidos.
Métodos Utilizados
- Projetar moldes utilizando software CAD e imprimi-los em 3D com plástico estável.
- Criar negativos de PDMS e poços de agarose para semeadura celular.
- Semear células nos poços de agarose e permitir que se agreguem em anéis de tecido.
- Avaliar os anéis de tecido formados quanto às propriedades estruturais e funcionais.
Resultados Principais
- Formaram-se com sucesso anéis de tecido a partir de diversos tipos celulares, incluindo células musculares lisas humanas.
- O método demonstrou flexibilidade no design das moldes e na fabricação de tecidos.
- Os anéis foram utilizados para avaliações in vitro da função tecidual e da resistência mecânica.
- Diferentes dimensões de anéis de tecido foram obtidas ao variar os diâmetros dos pinos nas moldes.
Conclusões
- Este protocolo fornece uma maneira simples e eficaz de criar anéis de tecido personalizados.
- Pode ser adaptado para diversas aplicações na engenharia de tecidos.
- A técnica aprimora o estudo de tecidos engenheirizados e suas propriedades.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite que equipes de P&D biofarmacêutica gerem anéis de tecido personalizáveis e livres de esqueleto para modelagem pré-clínica, apoiando a redução de riscos mecanicistas de candidatos terapêuticos. Ao permitir controle preciso sobre as dimensões e a composição do tecido, ele aumenta a confiança preditiva nas etapas iniciais de validação de alvos e no desenvolvimento de ensaios. A abordagem reduz a dependência de sistemas baseados em esqueletos, melhorando a relevância translacional para triagem de fármacos e aplicações de modelagem de doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio de anéis de tecido autoagregados que esclarecem a funcionalidade das vias e o engajamento do alvo.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos ao fornecer um sistema reprodutível para avaliar a modulação do alvo em contextos de tecido tridimensional.
- Valor Preditivo: Aprimora a triagem de portfólios ao gerar leituras funcionais que se correlacionam com as respostas em nível de tecido a compostos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Produz anéis de tecido padronizados e livres de suporte, adequados para avaliação quantitativa dos efeitos de compostos sobre a mecânica e função tecidual.
- Valor Operacional: Permite a prontidão do ensaio por meio da fabricação reprodutível de poços de agarose, reduzindo a variabilidade em campanhas de triagem posteriores.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma em diversos tipos celulares e modelos de tecidos, apoiando cascatas eficientes de avaliação de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta e a validação pré-clínica por meio da geração de anéis de tecido que imitam a estrutura nativa do tecido e suas propriedades mecânicas.
- Sistema Relevante para Doenças: Permite a modelagem de tecidos vasculares, cardíacos, musculares esqueléticos e de cartilagem utilizando fontes primárias ou derivadas de células-tronco.
- Avanço com Ajuste de Risco: Fornece desfechos funcionais e histológicos para orientar decisões de avançar ou não antes de estudos in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a fabricação de tecidos orientada por hipóteses, o que orienta a identificação de compostos líderes por meio de fenotipagem funcional e mecânica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a desmistificação mecanicista ao permitir que as equipes avaliem a formação, resistência e função tecidual dependentes do alvo em um ambiente tridimensional controlado.
- Triagem: Fornece anéis de tecido prontos para ensaio com dimensões consistentes, permitindo triagem confiável de compostos para fenótipos em nível tecidual.
- Análises: Oferece resultados quantitativos, incluindo diâmetro do tecido, força contrátil e marcadores histológicos, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Garante continuidade do descobrimento ao uso pré-clínico, gerando modelos de tecidos aplicáveis à avaliação mecânica, funcional e histológica.
- Reutilização Corporativa: Posiciona o fluxo de trabalho com moldes impressos em 3D como uma plataforma reutilizável para gerar diversos anéis de tecido em diferentes projetos e tipos celulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas interações com tecidos-alvo.
- Valor Operacional: Melhora a padronização e reprodutibilidade por meio da fabricação personalizável de moldes com baixa variância.
- Valor Estratégico: Aumenta a eficiência de capital ao permitir iterações rápidas de modelos de tecidos sem artefatos relacionados a scaffolds.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados funcionais precoces sobre modelos de tecidos engenheirados.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em design CAD, impressão 3D e técnicas estéreis de cultura de tecidos.
- Requer acesso a uma impressora 3D capaz de produzir peças plásticas brilhantes e termoestáveis, além de equipamentos padrão para preparação de PDMS e agarose.
- Exige padronização entre equipes dos parâmetros de design do molde, densidades de semeadura celular e condições de cultura para resultados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes tipos celulares ou alvos teciduais, particularmente em relação à concentração de agarose e diâmetro dos postes.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de moldagem precisa de agarose para evitar deformação dos poços e a importância de otimizar o número de células por poço para formação consistente de anéis.
