Fabricação de poços de Agarose personalizado para a propagação de células e tecido anel Self-assembly usando moldes 3D-impresso

O objetivo geral deste procedimento é criar moldes de semeadura de células personalizados que são usados para fazer anéis de tecido automontados de várias dimensões. Este método nos permite criar anéis de tecido tridimensionais a partir de células humanas que podem ser usados para avaliar a estrutura, força e função do tecido. A principal vantagem dessa técnica é que ela é um método simples para fabricar moldes para tecidos automontados com dimensões personalizadas.

Para iniciar o procedimento, use um software de design auxiliado por computador para criar um desenho de um molde nas dimensões desejadas. Envie o arquivo CAD para uma impressora 3D de alta resolução. Imprima o molde em um plástico com acabamento brilhante que seja estável a 50 graus Celsius.

Lave bem o molde impresso com pincel, detergente e água. Enxágue o molde com água destilada e deixe secar ao ar em uma gradinha. É importante escolher um plástico impresso em 3D que seja estável na temperatura de cura PDMS.

Resíduos que são transferidos para o PDMS durante o aquecimento podem afetar a formação do anel. Em seguida, meça 25 gramas de base PDMS em um barco de pesagem descartável. Adicione o agente de cura na proporção de 1:10 em peso e mexa vigorosamente até que a base e o agente de cura estejam bem misturados.

Em seguida, fixe fita de laboratório nas laterais do molde para formar uma parede de cerca de um centímetro de altura ao redor da face com os poços impressos. Certifique-se de que não haja lacunas na parede da fita. Despeje a mistura PDMS no molde impresso em 3D.

Desgaseifique o PDMS em uma câmara de vácuo por 30 a 60 minutos ou até que não haja bolhas. Cure o PDMS a 50 graus Celsius por duas a quatro horas ou até que o PDMS esteja suficientemente sólido para ser removido do molde. Em seguida, remova a fita e separe cuidadosamente o negativo PDMS do molde.

Incube o negativo PDMS em um forno a 60 graus Celsius por uma hora para garantir que esteja totalmente curado. Em seguida, lave bem o negativo com detergente e água. Enxágue o molde com água destilada e deixe secar ao ar.

Antes de fabricar o molde de agarose, autoclave o negativo PDMS, um par de pinças rombas e quaisquer outras ferramentas desejadas. Para iniciar a fabricação, prepare e autoclave pelo menos 50 mililitros de agarose a dois por cento em DMEM. Prepare poços de agarose um dia antes da semeadura do anel.

Pipete quatro mililitros de agarose derretida no negativo PDMS autoclavado, tomando cuidado para não encher demais o molde. Em seguida, pipete a agarose derretida nas cavidades para os postes do poço de agarose. Use a ponta da pipeta para remover todas as bolhas de ar.

A superfície final da agarose deve ser plana. Deixe a agarose esfriar por cerca de 10 minutos. Em seguida, use uma pinça romba para separar cuidadosamente o molde de agarose resfriado do negativo PDMS.

Coloque o molde voltado para cima em um poço de uma placa de seis poços. Adicione o meio de cultura completo apropriado ao poço da placa para que os poços de agarose fiquem completamente submersos. Equilibre os poços de agarose a 37 graus Celsius durante a noite antes de usar.

Primeiro, em uma placa de cultura de 15 centímetros, cultive células musculares lisas da aorta de ratos a 37 graus Celsius em uma atmosfera de dióxido de carbono a 5% até que 70% da confluência seja alcançada. Depois que o molde de agarose desejado for preparado e equilibrado durante a noite, lave o prato de cultura duas vezes com cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Depois de remover o PBS, adicione três mililitros de tripzin a 0,25% ao prato.

Incube a 37 graus Celsius por dois a três minutos ou até que as células tenham se levantado do prato. Neutralizar a tripzina com três mililitros do meio de cultura completo. Transfira as células para um tubo cônico e pipete suavemente as células até que estejam completamente ressuspensas.

Diluir um aliquat da suspensão celular com um volume igual de corante azul de tripano e contar as células com um hemocitômetro. Em seguida, centrifugue a suspensão a 200 vezes G durante cinco minutos. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura completo para atingir uma concentração de 10 milhões de células por mililitro.

As etapas mais importantes para garantir a formação consistente de anéis são otimizar o número de células e o meio de cultura para a linhagem celular que você está usando. Em seguida, obtenha os poços de agarose equilibrados. Aspire cuidadosamente todo o meio ao redor da parte externa da agarose e dentro dos poços de agarose, tomando cuidado para não perfurar o fundo dos poços.

Pipete 50 microlitros da suspensão celular em cada poço. Adicione dois mililitros de meio fresco ao redor da parte externa dos poços de agarose sem deixar o meio derramar nos poços. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius em uma atmosfera de cinco por cento de CO2 para permitir que as células se agreguem.

Em seguida, aspire o meio de fora da agarose. Adicione 4,5 mililitros de meio fresco ao poço do prato para que os poços de agarose sejam preenchidos e todo o molde de agarose fique completamente submerso. Continue incubando a placa até que os anéis de tecido estejam suficientemente desenvolvidos, substituindo o meio a cada dia.

Em seguida, deslize suavemente cada anel de tecido de seu poste usando uma pinça. Imediatamente, fixe os anéis para histologia ou use os anéis para avaliações funcionais ou mecânicas. A impressão 3D permitiu um design de molde mais flexível.

Os diâmetros dos postes eram facilmente variados, como mostrado em meus anéis de células musculares lisas de rato fabricados em torno de postes com diâmetros de dois, quatro e doze milímetros. Anéis de tecido também foram preparados a partir de SMCs humanas primárias, células-tronco mesenquimais humanas e SMCs derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas. Os anéis foram utilizados como modelos de tecidos in vitro para avaliações da função tecidual e resistência mecânica.

Embora esse método tenha sido originalmente projetado para fabricar e modelar tecido vascular, ele também pode ser usado para fabricar segmentos de outros tipos de tecido, como cartilagem, músculo esquelético e tecido cardíaco. Este método fornece uma maneira simples para os pesquisadores criarem moldes personalizados para fabricar anéis de tecido 3D com diferentes dimensões. Esses anéis podem ser usados para avaliar a estrutura, as propriedades mecânicas e a função de tecidos projetados feitos de diferentes tipos de células.