Name: Formulação de nanopartículas poliméricas através da técnica de dibloco Nanoprecipitation (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprenda a sintetizar nanopartículas poliméricas por nanoprecipitação usando copolímeros dibloco PLGA-PEG. Este método permite encapsular fármacos anticancerígenos pouco solúveis para terapia alvo.

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Este trabalho foi financiado pela Golfers Contra o Câncer, Carolina Centro de Nanotecnologia Excelência Pilot concessão, Cancer Research Fund e Universidade Nacional de Saúde Instituto K-12 Prêmio de Desenvolvimento de Carreira.

1. Síntese de PLGA-b-polímero PEG <ol><li> Poli (D, L-ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA) com terminal grupos carboxilato (PLGA-carboxilato) é dissolvido em qualquer solvente para PLGA (como mencionado na seção de materiais) na concentração de 5mM. PLGA pode ser dissolvido nesta concentração com agitação suave. </li><li> Ambos NHS (peso molecular 115,09) e EDC (peso molecular 191,7) são dissolvidos na solução PLGA em uma concentração de 25mM. (Ambos EDC e NHS são adicionados em um excesso estequiométrico de 5 vezes comparado ao PLGA). PLGA-carboxilato é convertida em PLGA-NHS adicionando EDC e NHS para PLGA-carboxilato solução com agitação suave por cerca de 1 hora. </li><li> O produto da reação PLGA-NHS é precipitado pela adição de metanol a solução de lavagem. Aproximadamente 10 vezes excesso de volume de metanol é adicionado à solução. A solução é centrifugada a 2000 xg para precipitar o PLGA-NHS e desprezar o sobrenadante (remove os traços de EDC e NHS. Este procedimento de lavagem com metanol é repetido pelo menos três vezes. </li><li> O pellet PLGA-NHS é seco sob vácuo por 30 minutos para remover qualquer vestígio da solução desengraxante. </li><li> O pellet PLGA-NHS é agora re-dissolvido no mesmo solvente na mesma concentração que foi usado inicialmente para dissolver PLGA. O PEG heterobifunctional (PEG-amina-carboxilato) é então adicionado à solução PLGA na concentração de 5mM (relação estequiométrica de 1:1). A solução mistura é incubada por 24 horas, com agitação constante. </li><li> Após 24 horas, o produto da reação PLGA-b-PEG copolímero em bloco é precipitado pela adição de metanol a solução de lavagem em excesso. Repita o processo de lavagem e centrifugação, tal como mencionado acima três vezes. Isto irá remover todos os PEG em excesso que não reagiu. </li><li> O PLGA-b-PEG copolímero em bloco é seco sob vácuo. </li></ol> 2. PLGA-b-PEG preparação de nanopartículas Nanopartículas de PLGA com núcleo coberto com PEG na superfície podem ser preparados com estes copolímeros dibloco. Uma variedade de diferentes drogas hidrofóbicas podem ser encapsulados em nanopartículas tal. Compostos fluorescentes podem ser encapsulados em nanopartículas de ou pode ser conjugado com PLGA e, portanto, essas nanopartículas podem ser usadas para imagens de fluorescência. Nanoprecipitation método é usado para fazer as nanopartículas especialmente quando a carga desejada para ser encapsulado é altamente hidrofóbico na natureza. <ol><li> O PLGA-b-PEG copolímero em bloco ea droga / carga (a ser encapsulados) são dissolvidos em qualquer solvente que dissolve PLGA. PLGA pode ser dissolvido por muitos solventes comuns, incluindo acetonitrila, DCM, tetrahidrofurano, acetona ou acetato de etila. A escolha do solvente é fundamental, pois influencia as propriedades de nanopartículas. Assim, solvente apropriado deve ser usado nesta etapa. </li><li> A mistura de polímero / medicamento é então adicionado gota a gota a 3-5 volumes de água mexendo, dando uma concentração de polímero final de cerca de 3 mg / mL. (Fig. 2) </li><li> A agitação é mantida por 2 horas sob pressão reduzida para permitir que as nanopartículas para formar por auto-montagem e remover vestígios do solvente orgânico. </li><li> Colheita e purificação: As nanopartículas são, então, concentrada por centrifugação a 2.700 x g por 10 min, utilizando um filtro Amicon (MWCO 20KDa), lavado e reconstituída em PBS. Isso remove todas as cargas não-entrapped droga /. Caracterizações básicas biofísicos, tais como tamanho, carga superficial, e eficiência de carregamento de drogas podem ser realizados para melhor compreender as propriedades das nanopartículas. </li></ol> 3. Armazenamento Liofilização é um método comumente usado para armazenar nanopartículas 11. Liofilização vai preservar as características físicas e químicas das nanopartículas para a estabilidade a longo prazo 12. O processo de liofilização pode causar estresse sobre as partículas e desestabilizar a formulação, por isso crio-protetores (proteção contra o estresse de congelamento) e lyo-protetores (proteção contra o estresse de secagem) são comumente usados. A escolha destes protetores é determinada pelo comprimento desejado do tempo de armazenamento 13. <ol><li> Na liofilização, há a solidificação total da amostra por congelamento abaixo de sua Tg. </li><li> Na etapa de secagem, o gelo é removido por sublimação. Temperatura e pressão devem ser otimizados para atingir um processo de liofilização eficiente. </li></ol> 4. Resultados representativos: Caracterização de Copolímero Di-bloco PLGA-b-PEG Diferentes técnicas podem ser usadas para confirmar a conjugação de sucesso de polímeros. A composição do PLGA-PEG-b podem ser caracterizadas usando um 400 MHz 1H de ressonância magnética nuclear (RMN). Peso molecular do produto formado (PLGA-b-PEG) pode ser verificada por cromatografia de permeação em gel (GPC). O PLGA-b - PEG repartição do peso molecularn curva e tempo de eluição deve ser diferente do PLGA e sozinho PEG. Em conjunto, essas técnicas devem caracterizar o produto formado e determinar se a reação de conjugação foi bem sucedida. Caracterização de PLGA-b-PEG nanopartículas Tamanho das partículas e distribuição de tamanho pode ser medido por espalhamento de luz dinâmico. Diferentes parâmetros no processo nanoprecipitation afetar o tamanho das partículas. Peso molecular dos polímeros usados ​​inicialmente (ambos PLGA e PEG) também efeito da distribuição de tamanho de partícula. Microscopia eletrônica de transição (TEM) também pode ser usado para confirmar a distribuição do tamanho e estrutura das nanopartículas como visto na figura 3. A faixa de tamanho de partícula é geralmente na faixa de nm. Tamanhos de partículas grandes, com distribuição de tamanho irregular pode indicar um erro na reação de conjugação ou o método de otimização nanoprecipitation necessidades. Além disso, o potencial zeta da superfície pode ser medida por ZetaPALS. A eficiência de carregamento de drogas / carga pode ser quantificado com o padrão HPLC. As partículas são dissolvidos em solvente orgânico e HPLC pode ser realizada para medir a absorvância da droga / carga (Fig. 4). O estudo de liberação do fármaco cinética pode ser feito quando conhecidos quantidades fixas das nanopartículas são dialisada em 30 Slide-A-Lyzer unidades de diálise MINI. Em intervalos fixos, o conteúdo na unidade de diálise é coletado e volume igual de solvente orgânico é adicionado para dissolver as nanopartículas. HPLC é feito sobre essas amostras para quantificar o conteúdo de drogas / carga. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. EDC / NHS química <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Nanoprecipitation método para a preparação de nanopartículas poliméricas. A solução orgânica de um solvente (acetonitrila ou DCM) que contém o dibloco PEG-PLGA ea droga ou carga a ser carregada para a partícula é adicionado gota a gota a 3-5 mL de H 2 O. mexendo <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Microscopia eletrônica de transmissão de nanopartices. A imagem TEM de PEG-PLGA contendo nanopartículas wortamin. Ácido fosfotúngstico foi usado como um agente de contraste. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Liberação controlada de drogas a partir de nanopartículas. Liberação de paclitaxel a partir de nanopartículas após a diálise em PBS. No momento observado, as partículas foram retirados a partir de cassetes de diálise e solublized em acetonitrila. A solução foi medido por HPLC. Dois lotes separados de nanopartículas foram comparados. <div id="myEventWatcherDiv"></div><div id="myEventWatcherDiv"></div>

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método nanoprecipitation usando dibloco co-polímeros representa um método simples e rápida de engenheiro nanopartículas poliméricas. As nanopartículas resultantes são compostos por um núcleo hidrofóbico que pode ser utilizado para a entrega de compostos pouco solúveis. A camada de superfície hidrofílica permite excelente solubilidade em água, proporcionando uma porção de conjugação mais potencial para um ligante alvo. Existem plataformas de nanopartículas muitos, incluindo os lipossomas, a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> EDC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22980 </td><td> Reagente conjugação </td></tr><tr><td> NHS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 24500 </td><td> Reagente conjugação </td></tr><tr><td> aminas PEG-carboxilato </td><td> Laysan Bio Inc. </td><td> NH2-PEG-CM-5000 </td><td> Polímero (Pode usar qualquer MW PEG, 5000 está listado aqui) </td></tr><tr><td> PLGA-carbxylate </td><td> Lactel </td><td> B6013-2 </td><td> Polímero </td></tr><tr><td> Diclorometano (DCM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34856 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> Acetonitrila&gt; pureza de 99% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34851 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> Metanol&gt; pureza de 99% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34860 </td><td> Lavar </td></tr></tbody></table>

formulação de nanopartículas poliméricas através da técnica de dibloco nanoprecipitation

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

A nanotecnologia é um ramo relativamente novo da ciência que envolve aproveitar as propriedades únicas de partículas que são nanômetros em escala (nanopartículas). Nanopartículas podem ser projetados de forma precisa onde a química tamanho, composição e superfície pode ser cuidadosamente controlada. Isto permite uma liberdade sem precedentes para modificar algumas das propriedades fundamentais da sua carga, tais como solubilidade, de difusividade, biodistribuição características, liberação e imunogenicidade. Desde a sua criação, as nanopartículas têm sido utilizados em muitas áreas da ciência e da medicina, incluindo a entrega da droga, imagem e biologia celular 1-4. No entanto, não foi totalmente utilizado fora de &quot;laboratórios de nanotecnologia&quot;, devido à percepção barreira técnica. Neste artigo, descrevemos um método simples para sintetizar uma plataforma de nanopartículas à base de polímeros que tem uma vasta gama de aplicações potenciais. O primeiro passo é sintetizar uma dibloco co-polímero que tem tanto domínio de um domínio hidrofóbico e hidrofílico. Utilizando PLGA e PEG como polímeros de modelo, descrevemos uma reação de conjugação usando EDC / NHS química 5 (Fig. 1). Discutimos também o processo de purificação de polímeros. O dibloco sintetizado co-polímero pode auto-organizar em nanopartículas no processo nanoprecipitation através hidrofóbico-hidrofílico interações. A nanopartícula de polímero descrito é muito versátil. O núcleo hidrofóbico da nanopartícula pode ser utilizado para transportar drogas pouco solúveis para a entrega da droga experiments6. Além disso, as nanopartículas podem superar o problema de solventes tóxicos para pouco solúveis reagentes de biologia molecular, tais como wortmannin, o que exige um solvente como o DMSO. No entanto, DMSO pode ser tóxico para as células e interferir com o experimento. Estes fármacos pouco solúveis e reagentes podem ser efetivamente entregue usando nanopartículas poliméricas com toxicidade mínima. Nanopartículas poliméricas também pode ser carregado com corante fluorescente e utilizados para estudos de tráfico intracelular. Por fim, essas nanopartículas de polímeros pode ser conjugado com a segmentação ligantes através PEG superfície. Tais nanopartículas alvo pode ser utilizada para rotular epítopos específicos em células ou em 10/07.

Este artigo descreve um método para sintetizar nanoprecipitation polímero baseado em nanopartículas usando dibloco co-polímeros. Vamos discutir a síntese de dibloco co-polímeros, a técnica nanoprecipitation e aplicações potenciais.

Formulação de nanopartículas poliméricas através da técnica de dibloco Nanoprecipitation

A nanotecnologia é um ramo relativamente novo da ciência que envolve a utilização das propriedades únicas de partículas em escala nanométrica...

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar nanopartículas poliméricas utilizando um método de nanoprecipitação. Isso é realizado primeiramente executando uma reação E-D-C-N-H-S para gerar o copolímero A-P-L-G-A PEG. O copolímero PLGA PEG é então utilizado para gerar nanopartículas, encapsulando o fármaco ou carga de interesse por meio de nanoprecipitação.Neste ponto, a caracterização biofísica básica, incluindo tamanho, carga superficial e eficiência de carregamento do fármaco, pode ser realizada por espalhamento dinâmico da luz, microscopia eletrônica de transmissão ou HPLC. As implicações desta técnica estendem-se à terapia de tumores, pois as nanopartículas podem veicular terapêuticos antineoplásicos pouco solúveis, os quais podem ser mais eficazes do que os tratamentos atuais. Embora este método possa fornecer insights sobre o tratamento do câncer.Ele também pode ser utilizado para estudar outros sistemas, como o tráfego celular. As nanopartículas podem ser conjugadas com um ligante de direcionamento e visualizadas in vivo ou in vitro por meio do uso de um agente de imagem, demonstrando a técnica. Hoje estarão dois técnicos do nosso laboratório, Rohit Sukumar e Natalie Cummings, para iniciar a síntese do copolímero PLGA PEG, dissolvendo PLGA, carboxilato, em acetonitrila numa concentração de cinco milimolar com agitação suave.Em seguida, adicione quantidade suficiente de NHS e EDC para obter concentrações de 25 milimolares, fornecendo um excesso estequiométrico de cinco vezes em comparação com o PLGA; agite suavemente a solução por cerca de uma hora para permitir que o carboxilato de PLGA seja convertido em PGA-NHS. Após uma hora, precipite o produto da reação PGA-NHS adicionando a solução de lavagem, metanol, em volume aproximadamente dez vezes maior, em excesso em relação à solução; centrifugue a solução a 2000 × g para formar o pellet do PGA-NHS. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante para remover traços de EDC e NHS. Este procedimento de lavagem com metanol é repetido pelo menos três vezes.Após a lavagem estar completa, seque o pellet de P-L-G-A-N-H-S sob vácuo por 30 minutos para remover quaisquer vestígios da solução de lavagem. Em seguida, redissolva o pellet de P-L-G-A-N-H-S em acetônitrila na mesma concentração que foi inicialmente utilizada para dissolver o PLGA.Uma vez dissolvido, adicione o PEG heterobifuncional à solução de PLGA. Adicione uma concentração de cinco milimolar.Incube a solução da mistura por 24 horas com agitação constante após 24 horas. Precipite o produto da reação do copolímero em bloco PLGA PEG adicionando metanol em excesso. Realize o processo de lavagem e centrifugação adicionalmente três vezes para remover todo o PEG não reagido em excesso.Como etapa final da síntese, seque o copolímero em bloco PLGA PEG sob vácuo. A precipitação de nanopartículas começa com a dissolução do copolímero em bloco PLGA PEG e do fármaco a ser encapsulado no solvente A-P-L-G-A. A escolha do solvente é crítica, pois influencia as propriedades da nanopartícula. Em seguida, adicione a mistura de polímero e fármaco, gota a gota, a três a dez volumes de água sob agitação, para obter uma concentração final de polímero de cerca de três miligramas por mililitro. Gota a gota.A adição da solução orgânica à fase aquosa é essencial para a formação de nanopartículas do tamanho correto. Continue a agitação por duas horas sob pressão reduzida para permitir que as nanopartículas se formem por autoagregação e remova traços do solvente orgânico. Após duas horas de agitação.Concentre as nanopartículas por centrifugação a 2.700 × g durante 10 minutos usando um filtro Amon. Em seguida, lave as nanopartículas com PBS para remover qualquer fármaco não encapsulado e proceda com nova centrifugação. Por fim, reconstitua as nanopartículas em PBS neste ponto.A caracterização biofísica básica, incluindo tamanho, carga superficial e eficiência de carregamento de fármaco, pode ser realizada para compreender melhor as propriedades das nanopartículas. As nanopartículas podem ser armazenadas conforme descrito no protocolo escrito; para caracterizar as nanopartículas de PLGA PEG, foi utilizada microscopia eletrônica de transmissão para confirmar o tamanho, distribuição e estrutura das nanopartículas. O tamanho das partículas geralmente está na faixa de nanômetros.Tamanhos grandes de partículas com distribuições de tamanho irregulares podem indicar um erro na reação de conjugação ou que o método de nanoprecipitação precisa ser otimizado. Aqui é apresentado um estudo cinético de liberação de fármaco no qual a eficiência de incorporação e a liberação de paclitaxel foram quantificadas por HPLC padrão. Quantidades fixas conhecidas das nanopartículas foram submetidas à diálise em intervalos de tempo fixos.O conteúdo da unidade de diálise foi coletado e um volume igual de solvente orgânico foi adicionado para dissolver as nanopartículas. Em seguida, foi realizada a CLAE nessas amostras. Para quantificar o teor de paclitaxel, uma vez dominada, essa técnica de nanoprecipitação pode ser adequadamente realizada em três horas.Lembre-se de que, ao realizar esta técnica, é sempre necessário adicionar lentamente a fase orgânica à fase aquosa para evitar a formação de partículas grandes após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores de câncer na área da nanomedicina explorarem o uso de fármacos pouco solúveis que antes eram considerados tóxicos demais para pacientes com câncer após este procedimento. Outros métodos, como estudos de eficácia in vivo ou estudos de imagem, podem ser realizados para responder perguntas como se fármacos pouco solúveis são eficazes, quando a toxicidade sistêmica já não é um problema, ou se ligantes de direcionamento direcionam adequadamente as nanopartículas ao seu destino.

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Um protocolo para a análise de nanopartículas de seguimento (NTA) e de alto rendimento de citometria de fluxo para avaliar as nanopartículas poliméricas entrega de genes é descrito. NTA é utilizada para caracterizar a distribuição do tamanho de partícula das nanopartículas e a distribuição de partículas por plasmídeo. De alto rendimento de citometria de fluxo permite a avaliação da eficácia de transfecção quantitativo para uma biblioteca de biomateriais de entrega de genes.

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Descreve-se o método de células-tronco de programação para superexpressão fatores terapêuticos para angiogênese utilizando nanopartículas poliméricas biodegradáveis. Processos descritos incluem a síntese do polímero, a transfecção de células estaminais derivadas de tecido adiposo, in vitro, e para validar a eficácia das células estaminais programadas para promover a angiogénese num modelo de isquemia dos membros posteriores de murino.

Células-tronco de programação para Therapeutic angiogênese Usando nanopartículas poliméricas biodegradáveis

Dois fluidos adjacentes que passam por um canal microfluido ranhurado podem ser direcionados para formar uma baia em torno de um núcleo prepolímero; determinando, assim, tanto a forma quanto a seção transversal. A polimerização fotoincializada, como a química do clique de tiol, é adequada para solidificar rapidamente o fluido do núcleo em uma microfibra com tamanho e forma predeterminados.

Fabricação microfluida de fibras poliméricas e biohibridas com tamanho e forma predesigned

Aprenda a sintetizar nanopartículas poliméricas por nanoprecipitação usando copolímeros dibloco PLGA-PEG. Este método permite encapsular fármacos anticancerígenos pouco solúveis para terapia alvo.

Formulação de nanopartículas poliméricas através da técnica de dibloco Nanoprecipitation

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