Células-tronco de programação para Therapeutic angiogênese Usando nanopartículas poliméricas biodegradáveis

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o uso de nanopartículas poliméricas para a superexpressão de genes terapêuticos em células-tronco usando um modelo de isquemia de membros posteriores marinhos. Isso é feito primeiro sintetizando polímeros biodegradáveis por meio de uma reação de edição de microfone em duas etapas, seguida pela fabricação de nanopartículas poliméricas que codificam genes terapêuticos. O segundo passo é transfectar células-tronco derivadas de tecido adiposo humano in vitro em fator de crescimento endotelial vascular superexpresso.

Em seguida, as células-tronco programadas são injetadas por via intramuscular em um membro posterior isquêmico para a produção de fatores terapêuticos NC dois. A etapa final é monitorar a sobrevivência celular e a reperfusão sanguínea no membro isquêmico ao longo do tempo usando imagens de bioluminescência e imagens doppler a laser. Em última análise, a expressão gênica quantitativa e a histologia podem ser realizadas para mostrar a expressão localizada de fatores terapêuticos e a eficácia da regeneração tecidual.

A vantagem dessa técnica sobre os métodos convencionais de angiogênese é o uso de células-tronco como veículos para a liberação de fármacos. Essa estratégia nos permite empregar a capacidade natural de capina das células-tronco para migrar em direção à isquemia e também permite respostas dinâmicas a pistas microambientais. As nanopartículas usadas para entrega de DNA plasmático são altamente eficientes e biodegradáveis, proporcionando menor citotoxicidade e um maior número de cópias de DNA entregues intracelularmente.

Essa técnica pode ser aplicada a muitas terapias baseadas em células clinicamente relevantes porque utiliza um vetor não viral biodegradável para inserir genes em células autólogas Trabalhando em uma capela de exaustão, pesar o mostrador de butano DLI e transferir o material para um frasco de inalação de vidro contendo uma barra de agitação. Em seguida, adicione cinco amino um pentol pré-aquecido ao mesmo frasco. Coloque imediatamente o frasco para injetáveis em uma placa de agitação e ajuste a velocidade para 600 RPM.

Transfira o frasco para um forno regulado a 90 graus Celsius e aumente a velocidade de agitação para 1000 RPMs após quatro horas, diminua a velocidade para 300 RPM e mexa por mais 12 a 16 horas. Quando estiver pronto, adicione 10 mililitros de tetra hidro urano anidro a cinco gramas de C 32 em um frasco de vidro contendo uma barra de agitação. Depois de embrulhar em papel alumínio em vórtice alto até dissolver totalmente em um frasco de vidro separado contendo uma barra de agitação, adicione 10 milimolares de tetraetilenoglicol diamina.

Adicione 40 mililitros de THF a este frasco e coloque os dois frascos em uma placa de agitação por cinco minutos antes de combiná-los. Cubra o resultante com papel alumínio e deixe-o à temperatura ambiente por 24 horas. O produto final é denominado C 32 1 22.

Em seguida, transfira 30 mililitros de éter datilo anidro para cada um dos cinco tubos de falcão de 50 mililitros. Depois de adicionar C 32 1 22 ao éter dyl anidro, uma solução turva branca forma um vórtice no tubo e depois o centrifuga. O polímero extraído se acumulará na base do tubo, descartará a solução superior e repetirá essas etapas mais duas vezes.

Uma vez extraídos, coloque os tubos abertos no dessecador e aspire durante a noite, certifique-se de que os tubos estejam protegidos da luz. No dia seguinte, pesar os tubos contendo C 32 1 22 para determinar a massa final. Por fim, dissolver o polímero extraído em DMSO anidro na concentração de 100 miligramas por mililitro.

Para preparação de nanopartículas. Primeiro, diluir o DNA plasmático até uma concentração final de 120 microgramas por mililitro em acetato de sódio em um segundo tubo, diluir C 32 1 22 até uma concentração final de 3,6 miligramas por mililitro. Em acetato de sódio, combine o conteúdo de cada tubo em um único tubo Falcon de 15 mililitros e votice imediatamente em alta por 10 segundos.

Deixe o tubo descansar em temperatura ambiente por 10 minutos para que a formação de nanopartículas ocorra enquanto as nanopartículas estão se formando. Substituir o meio num balão de cultura de tecidos previamente assentado por 7,8 ml. DMEM totalmente suplementado.

Transfira a solução de nanopartículas para o frasco de cultura de tecidos e espalhe-a uniformemente antes de colocá-la na incubadora. Após duas horas, substitua a nanopartícula contendo o meio por DMEM. Após quatro horas, as células estão prontas para injeção in vivo.

Quando as células transfectadas estiverem prontas, conte as células a uma densidade de 10 vezes 10 das seis células por mililitro em PBS para garantir que cada camundongo receba uma quantidade igual. Separar as suspensões celulares em tubos einor com um volume de 110 microlitros. Em seguida, anestesiar um camundongo que já sofreu isquemia de membros posteriores.

Depois de confirmar a anestesia por pinça do dedo do pé, limpe o local da injeção com uma seringa de calibre 27. Suspender novamente as células e retirar 100 microlitros da suspensão. Injete metade da suspensão celular na região do músculo adutor e, em seguida, injete a outra metade na região do músculo da panturrilha.

Após a injeção, deixe a seringa no lugar durante pelo menos 15 a 30 segundos para evitar fugas. Quando as injeções estiverem completas, mantenha o animal aquecido até que esteja totalmente recuperado. Para imagens de bioluminescência, confirme a anestesia com uma pitada no dedo do pé e, em seguida, limpe o local da injeção conforme mostrado anteriormente.

Encha uma seringa de insulina com 100 microlitros de Lúcifer e injete-a intraperitoneal. Antes de colocar o animal na câmara de imagem da ivus luciferase, faça uma imagem dos camundongos com um tempo de exposição de um minuto. Quando a imagem for adquirida, marque a região de interesse.

Nesse caso, o membro isquêmico no local da injeção celular continua a medir o sinal da luciferase a cada três a cinco minutos até que o sinal atinja um pico e comece a diminuir. Este é o valor usado para comparação entre camundongos e, ao longo do tempo, quando concluído, remova os camundongos da câmara e mantenha o animal aquecido até que esteja totalmente recuperado. Os tecidos são colhidos em um momento selecionado.

Pontos após a transfecção após a eutanásia, cortam a pele ao redor do membro posterior circunferencialmente na região abdominal distal e proximal ao membro posterior. Depois de puxar a pele para trás, ampute o membro entre a articulação pélvica e o fêmur. Finalmente, o adutor medial e os músculos gastrocnêmicos são isolados.

Para análise posterior, essas imagens retratam a síntese de C 32 1 22. Aqui, o C 32 AC terminado relacionado ao ACR foi formado por uma reação de edição de microfone entre um monômero com grupos finais DAL e um monômero com um grupo final médio primário. Neste exemplo, os polímeros PBAE modificados podem ser formados pela adição de monômeros terminados médios para maior eficiência de transfecção.

Uma transfecção bem-sucedida é aparente pela superexpressão da proteína fluorescente verde, como visto aqui. Esses dados de imagem de bioluminescência mostram um camundongo no dia zero e no dia 14. Após a injeção de células-tronco derivadas de tecido adiposo positivo para luciferase GFP no membro posterior, imagens representativas do Doppler demonstram a indução de isquemia em um lado do membro posterior espelhado no dia zero e reperfusão sanguínea bem-sucedida.

14 dias após a injeção de VEGF sobre a expressão de células-tronco derivadas do tecido adiposo. R-T-P-C-R confirmou a regulação positiva bem-sucedida de vgf, a proteína terapêutica codificada no grupo tratado quatro dias após a injeção celular, enquanto nenhuma expressão foi detectada no controle PBS. Outros métodos que aplicam uma abordagem combinada de entrega de células-tronco e genes podem ser realizados para identificar novos alvos terapêuticos para promover a regeneração tecidual.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar polímeros biodegradáveis para terapia gênica não viral e usar esses polímeros para programar células-tronco para o tratamento de isquemia e vivo O uso de células-tronco não virais projetadas para superexpressar fatores terapêuticos in situ pode ser amplamente útil para o tratamento de uma variedade de doenças degenerativas.