Análise Quantitativa de Migração aleatória de células usando microscopia de lapso de tempo vídeo

O objetivo geral do experimento a seguir é medir quantitativamente a migração de células em tempo real usando microscopia de lapso de tempo de vídeo. Isso é conseguido primeiro revestindo uma placa de cultura de seis poços com colágeno e, em seguida, semeando esparsamente as células de interesse na placa revestida. Como segundo passo, uma ferida é criada na placa usando uma ponta de pipeta, garantindo amplo espaço para migração.

Em seguida, o microscópio é configurado e as imagens são capturadas em intervalos regulares usando um sistema de controle de temperatura para permitir o monitoramento contínuo das células migratórias em tempo real. Em última análise, o protocolo de rastreamento de partículas é usado para avaliar as diferenças na velocidade média e no deslocamento total das células de teste e controle. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o ensaio de migração de câmara evitativa, é que ela não se baseia em medições de migração quantitativa de endpoint.

Em vez disso, permite monitorar e calcular diferentes parâmetros continuamente. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do câncer, como como genes ou medicamentos específicos afetam a migração de células tumorais? Dois dias antes do procedimento, adicione 1,5 mililitros de colágeno diluído em opti media a cada poço de uma placa de cultura de seis poços e, em seguida, incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius um dia antes do procedimento.

Ressuspenda as células de interesse em dois mililitros de DMEM mais FBS por poço e transfira as células para cada poço da placa revestida com colágeno ENC, incubando as células durante a noite a 37 graus Celsius. No dia do procedimento. Use uma ponta de pipeta para criar uma ferida nas células cultivadas durante a noite e lave cada poço com PBS para remover quaisquer detritos que se formaram como resultado da ferida.

Adicione DMEM mais FBS aos poços enxaguados e, em seguida, verifique ao microscópio se foi criado um espaço limpo para a ferida. Depois de ligar a câmera do microscópio e o aparelho de imagem de células vivas, posicione a placa sobre a platina do microscópio. Cubra a placa pela nova câmara de controle ambiental de célula viva e ajuste o termostato para 37 graus Celsius e o dióxido de carbono para 5% Agora abra o software do livro de slides na barra de menus.

Selecione o controle de foco clicando no botão F dentro de um círculo. Na caixa de objetivo, use a janela suspensa para definir o objetivo Na caixa de conjunto de filtros, selecione as configurações para direcionar o caminho da luz para a peça I. Selecione o filtro apropriado para Bright Field Illumination e clique em abrir Bright.

Para abrir o obturador de campo claro. Agora selecione o filtro de campo claro na torre e visualize a amostra através da ocular para encontrar os campos apropriados e colocar a amostra em foco. Em seguida, mova a torre do filtro para alterar o caminho da luz para a câmera Para captura de imagem no software do livro de slides, clique no controle de foco, selecione XY para selecionar diferentes posições através da peça I e, em seguida, clique no ponto de ajuste para travar em cada local.

Para captura de imagem, ajuste manualmente o foco da imagem da câmera exibida na tela e use as ferramentas na janela de controles de foco para ajustar a posição Z do palco. Para obter melhores resultados, concentre-se nas saliências celulares planas próximas ao contato com a placa para ajudar no foco. Use o controle deslizante para ajustar os tempos de exposição para estar em uma faixa apropriada para focagem.

Se várias posições XY tiverem sido selecionadas, ajuste o foco para cada posição individual selecionando o controle de foco. Em seguida, xy, depois visite o ponto. No livro de slides, selecione o gráfico da câmera na barra de menus, selecione o tipo de captura e, em seguida, lapso de tempo para selecionar o período de tempo do experimento.

No menu suspenso, digite o atraso desejado entre o início de um ponto no tempo e o início do próximo. Nos campos de intervalo, o terceiro campo será calculado automaticamente a partir dos valores inseridos manualmente. Em captura XY múltipla, selecione a lista de vários pontos para experimentos com mais de uma posição XY.

Por fim, nomeie o arquivo para salvá-lo, vá para controle de captura e selecione avançado e, em seguida, spool. Em seguida, capture na memória e salve no arquivo de spool após cada ponto de tempo. Comece clicando na imagem.

Na barra de menu do livro de slides, selecione importar no menu suspenso e clique no carretel do livro de slides. Selecione os arquivos de livro de slides desejados gerados a partir do experimento de migração para vários campos e pontos de tempo. Abra o primeiro arquivo, selecione máscara na barra de menus e escolha o protocolo de rastreamento de partículas no menu suspenso.

No menu de rastreamento de partículas, escolha o protocolo de rastreamento manual de partículas. Uma janela aparecerá com pontos de tempo de início e término Para analisar a migração aleatória, selecione máscara e, em seguida, protocolo de rastreamento de partículas. Novamente, para determinar as coordenadas para o centro do objeto, selecione o centro da área.

Em seguida, clique em rastrear e continuar. Agora escolha as estatísticas desejadas para cada caminho, como deslocamento e velocidade média. Conforme mostrado aqui, clique em calcular para exibir as estatísticas.

Um exemplo de uma análise de migração aleatória quantificada em termos de velocidade é mostrado nesta caixa. No gráfico de Whiskers, neste experimento, houve um aumento na velocidade média em células M-D-A-M-B 2 31 com um gene supressor de tumor derrubado. Em comparação com as células de controle M-D-A-M-B 2 31 aqui, a migração aleatória das células da primeira figura foi analisada em termos de deslocamento celular.

Novamente, o grupo de knockdown do gene supressor de tumor total teve um deslocamento celular aumentado em comparação com o controle M-D-A-M-B 2 31. As células neste controle de vídeo microscopia de vídeo com lapso de tempo MDA MB 2 31 células foram assentadas no colágeno durante a noite. As imagens foram então tiradas em intervalos de uma hora por um total de 18 horas durante a migração aleatória.

Observe como as células se afastam de suas posições originais ao longo do tempo. Neste filme, a migração de células MDAB 2 31 após a semeadura noturna em colágeno foi registrada e analisada. Observe que as células de teste são mais migratórias em comparação com as células de controle do filme anterior.

Após este procedimento, outros métodos como invasão celular e dinas podem ser realizados para responder a perguntas adicionais como: quais são os papéis das células na metástase do câncer após seu desenvolvimento? Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular explorarem a migração celular usando linhagens de células cancerígenas isoladas.