Name: Avaliação da GFP Expressão e Viabilidade Usando o Tali Citómetro Baseado na Imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprenda a avaliar viabilidade celular e expressão de GFP usando o citômetro baseado em imagem Tali. Este método fornece dados quantitativos e visuais simultâneos sobre populações celulares em estudos de biologia celular.

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1. Células coradas com o Kit de Viabilidade Tali - Reagente Celular Red Dead <ol><li> Iniciar este procedimento com células U2OS (Coleção American Type Culture) que foram transduzidas usando CellLight Núcleo-GFP * BacMam 2,0 *. (Nota: As células podem também ser girado para baixo e ressuspenso em médio ou PBS). </li><li> Para manchar as células mortas com a PI, a transferência de 100 L das células para um tubo de microcentrífuga novo. Note-se que uma concentração de 1 x 10 5 a 1 x 10 7 células / ml é recomendado para este ensaio, embora a concentração não tem que ser exato. </li><li> Em seguida, a manchar as células mortas, adicionar 1 mL do reagente de PI baseada celular Tali Red Dead. Vortex brevemente para misturar. Incubar a Tali reagente Red Dead Cell e mistura de células em temperatura ambiente no escuro por 1-5 minutos. </li><li> Após a incubação, imediatamente proceder à análise da amostra no citómetro Tali Image-Based. </li></ol> 2. Realizar um ensaio de viabilidade celular Usando umTali Citómetro Baseado na Imagem <ol><li> O citômetro de Tali usa o plástico descartável Tali Slides Análise Cellular que especificamente se encaixam no citômetro e pode armazenar duas amostras 25μL em separado câmaras fechadas (A e B). Ao manusear o slide, não se esqueça de sempre mantê-la pelos lados. </li><li> Para carregar o slide, pipetar 25 mL da amostra lentamente na metade da área de carga em forma de lua amostra, tomando cuidado para evitar bolhas se formando ou para trás splatter. Não sobre ou sob a preencher. </li><li> Aqui, as células controle (sem manchas, não transduzidas) são carregados na câmara A ea GFP manchada células que expressam são carregados na câmara B. A amostra de controlo vai ajudar a determinar o nível de autofluorescência ao analisar os dados. </li><li> Para realizar um ensaio de viabilidade, toque GFP / RFP na tela inicial do citômetro. As opções de ensaio aparecerá à direita. Selecione GFP Viabilidade +. </li><li> Em seguida, para o nome da série de amostras, pressione Nome Agora </strong&gt;. Então, usando a tela sensível ao toque, digite o nome da série de amostras, e pressione Salvar. (Nota: Selecionar Nome Mais tarde, para atribuir automaticamente um nome para cada série de amostras por data e hora). </li><li> Depois de nomear a amostra, o citômetro de Tali avançará automaticamente para a tela Medida. Pressione a guia Plano de fundo na metade inferior direita da tela Medida. </li><li> Em seguida, com a amostra controle (A) de costas para o citómetro, inserir o slide no porto de carregamento até que ele pare. Não aplique força. </li><li> Na tela de fundo, toque Prima para Inserir controlo celular New corado. O slide irá automaticamente ser puxado para o citómetro e uma imagem ao vivo das células será exibido na tela. </li><li> Usando o botão de foco, trazer as células para o plano adequado de vista. As células devem ser uniformemente escuro, com um halo brilhante em torno de cada célula (Figura 1, esquerda). </li><li> Células pode ser undercounted quando a transição entre o fundo e as bordas das células é difuso, de modo que os limites da célula não são bem definidos (Figura 1, Centro). Células podem ser overcounted quando eles têm centros de brilhante e perímetros escuro (Figura 1, direita). </li><li> Para melhor visualizar a população de células enquanto se concentra, deslize o botão indicador vermelho Zoom de 4X ou 16X. </li><li> Quando as células foram trazidos para o foco, toque Prima para Run controlo celular não corado para medir a fluorescência de fundo. </li><li> O citômetro automaticamente capturar e analisar as imagens da amostra. Demora cerca de um minuto para capturar e analisar as imagens no padrão (9 imagem) mode. </li><li> Miniaturas de cada campo de visão são exibidos como eles são capturados ea barra de progresso fornece uma atualização em andamento. Após a captura de imagem estiver concluído, o citômetro de ejecta automaticamente o slide e fornece os dados a partir da análise das imagens capturadas. </li><li>Os dados armazenados serão exibidos no menu drop-down da guia de fundo no citômetro. A amostra controle de fundo será atribuído o mesmo nome que deu à experiência e será importado no menu suspenso. Nota: Se um controle de fundo não é executado, o citômetro atribui automaticamente um limiar de fluorescência. Isto pode ser alterado manualmente após a realização do ensaio. </li><li> Para executar o exemplo PI-transduzidas manchada, remova a lâmina do citômetro, lançá-lo ao redor e reinseri-lo com a amostra transduzidas de costas para o instrumento. </li><li> Pressione a aba da amostra, e em seguida, toque Prima para Inserir nova amostra. Quando a imagem aparece na tela, use o botão de ajuste de imagem para trazer as células em foco como antes. Em seguida, toque de Imprensa to Run Sample. </li><li> Após a captura da imagem estiver concluído, os dados da análise aparece sob a guia da amostra eo automática citómetroaliado ejeta o slide. </li><li> Adequadamente dispor do slide Análise Tali Cellular como resíduos perigosos. Slides Análise Tali celulares não podem ser reutilizados. </li></ol> 3. Limiares configuração e Gates <ol><li> Uma vez que a amostra foi executado, os limiares podem ser aplicados à amostra em casa, em uma população de células específicas. Aqui, vamos ajustar os limiares para determinar a porcentagem de células vivas e mortas no GFP-transduzidas células. </li><li> Sob a guia de amostra, o número ea porcentagem de células expressando GFP, as células vivas e mortas expressando GFP, viabilidade total, tamanho da célula média, número de células contadas, e concentração de células são exibidos. </li><li> Além disso, histograma mostrando o tamanho da célula, a fluorescência verde e fluorescência vermelha (PI) são exibidas na parte inferior da tela. </li><li> Para definir o tamanho da célula portão, toque na miniatura Tamanho da Célula para abrir o histograma do tamanho das células. Enquanto as células cultivadas raramente têm debris, outras amostras podem conter restos que é maior ou menor do que as células. </li><li> Para excluir os entulhos, deslize os botões azuis na barra de deslocamento para excluir eventos grandes e pequenos. Em seguida, toque em Aplicar para re-analisar os dados e atualizar os resultados. </li><li> Em seguida, adicionar a fluorescência da GFP para a análise, toque na miniatura histograma GFP para abri-lo. Deslize a barra azul para definir o limite à direita do pico mais escuras, usando a amostra de controlo como um guia. </li><li> Isso permite que a análise para incluir as células GFP positivas, mas excluem as células autofluorescent. Autofluorescência é freqüentemente observada quando as moléculas dentro das células biológicas são animado. </li><li> Toque em Aplicar para confirmar e voltar à tela anterior. Os dados exibidos na guia Sample agora deve refletir as portas e limiares definidos para ambos os canais de fluorescência. </li><li> Em seguida, para separar as células manchadas de autofluorescência PI, pressione tele PI histograma de miniaturas para abrir o histograma PI. </li><li> Mais uma vez, o pico de amostra de controlo será exibido como um pico de cinza no histograma. O pico de fluorescência vermelha é a amostra. A fluorescência de fundo é exibida como um pico mais próximo do valor RFU 0 nesta citômetro. </li><li> Para eliminar a fluorescência de fundo no canal PI, mova o botão azul na barra de controle deslizante para ajustar o limite de excluir o pico representando fluorescência de fundo, utilizando o pico de cinza a partir da amostra de controlo como uma referência. Toque em Aplicar para confirmar e voltar à tela anterior. </li><li> Em seguida, para confirmar visualmente que cada célula é corretamente atribuída, selecione um campo de vista capturados para revisão, pressionando a miniatura da imagem no separador Zoom, em seguida, pressionando a aba Layers. </li><li> Em seguida, pressione o botão ou GFP PI, para exibir a imagem capturada através desse canal em particular. Pressione o mesmo botão novamente para remover a camada da tela, ou, para sobrepor camadas, toque no botão de múltiplas camadas. </li><li> Para identificar como as células são contadas através de um canal particular, Círculos toque. As células que foram contados por meio apenas o canal brilhante-campo, que não expressam de fluorescência serão circuladas em azul. Isso indica que essa célula em particular é ao vivo (ou seja, PI negativo). </li><li> Células GFP expressando será visto no canal de GFP, e será circulada em verde. Células mortas coradas com Red Dead Cell será visto no canal de PI, e será circulada em vermelho. </li><li> Células contadas em ambos os canais do vermelho e verde serão circulados em amarelo, isso indica que a célula expressa GFP, mas também é corado com PI e, portanto, está morto. </li><li> Ocasionalmente, círculos pretos aparecerá na tela, estes são objetos que foram identificados, mas foram excluídos da análise com base no tamanho da célula. </li><li> Continuar a fine ajustar o limite no histograma de fluorescência usando as etapas acima descritas, até que cada célula que está expressando fluorescência é circulado com a cor apropriada. </li><li> Todos os parâmetros de análise são salvos automaticamente na guia dados. O citômetro de Tali pode armazenar arquivos de dados de aproximadamente 500 corre amostra. </li><li> Cada arquivo armazenado na guia de dados está disponível para reanálise. Ao selecionar o arquivo a partir do separador de dados será aberta e todos os histogramas e camadas tornam-se ativos. </li><li> Para arquivar dados e gerar relatórios, os dados armazenados no citômetro podem ser transferidos para um computador usando um drive USB. </li></ol> 4. Resultados representativos: A Imagem-Baseado Tali Citómetro foi usado para medir o nível de expressão de proteínas fluorescentes em células que foram transduzidas com um BacMam GFP nuclear-alvo construir expressão 2.0. Quatro tipos de células representativas foram transduzidas (U2OS, 293MSR, HEKn e CHO-S).Para estas linhas celulares, o número de células que estavam expressando GFP foi relatado pelo citômetro de Tali e comparados com os dados das mesmas amostras analisadas em um citômetro de fluxo. Além disso, as células foram coradas com o reagente Celular Red Dead usando o Kit de Viabilidade Tali para identificar a população de células mortas tanto no citômetro de Tali e em um citômetro de fluxo. As representações gráficas na Figura 2 mostra o percentual da população total para cada tipo de célula que estavam expressando GFP. Estes dados demonstram que o citómetro Tali produz dados comparáveis ​​aos dados gerados por um citômetro de fluxo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig1.jpg" /> Figura 1. Células devem ser devidamente focado antes da análise. Slides Análise Tali celular com concentrações célula apropriada para a análise (1 x 10 5 a 1 x 10 7 células são recomendados). (LEFT) em foco células são uniformemente darca toda a célula, com um halo brilhante em torno de cada célula de células. (CENTER) pode ser undercounted quando a transição entre o fundo e as bordas das células são difusas e as células têm limites indefinidos (RIGHT) Células talvez overcounted quando têm brilhantes centros e perímetros escuro. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig2.jpg" /> Figura 2. Dados proteína fluorescente expressão do Citómetro Tali baseada em imagem é comparável à obtida por citometria de fluxo. A comparação lado a lado de cálculo GFP-expressão resulta em 4 linhas de células diferentes em células viáveis.

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Krissy Remple Laurel e Pedra são funcionários da Life Technologies, que produziu o instrumento utilizado neste artigo. Life Technologies tem patrocinado a produção deste vídeo-artigo.

Temos apenas um procedimento detalhado para a realização de contagens de viabilidade e avaliar a expressão do GFP utilizando a imagem baseada em Tali citómetro. Usando o mesmo procedimento, este citómetro é capaz de realizar uma série de outros ensaios, incluindo: apoptose, RFP e análise de viabilidade celular utilizando células não-transduzidas. Ensaios fluorimétricos de viabilidade celular, expressão gênica e apoptose tornaram-se metodologias de chave na pesquisa biomédica 7-12. Na instrumentação, separados passado foi usado para obter informações quantitativas e visuais sobre as células. Embora as informações quantitativas sobre células dentro de uma população heterogênea tem sido garnered através do uso de citometria de fluxo, a informação visual ou qualitativa foi recolhida através do uso de microscopia de fluorescência 1-4. Aqui, apresentamos uma tecnologia que faz a ponte entre população e estudos de células individuais. Usando o Tali Citómetro Image-Based, quantitativa data e os dados das células visuais sobre células individuais ou populações de células podem ser coletados simultaneamente. O instrumento Tali pode ser usado para uma variedade de aplicações incluindo a avaliação da expressão gênica, ensaios de apoptose, estudos de eficácia de drogas e avaliação da progressão da doença. A Imagem-Baseado Tali captura citómetro e análises de campo brilhante fluorescência, vermelho e verde imagens de fluorescência, permitindo que informações sobre subpopulações de células a serem obtidos. Por exemplo, neste ensaio, fomos capazes de distinguir as células mortas de células vivas dentro do GFP-expressando população de células usando células mortas corante Vermelho. Isso dá a precisão na medição de células viáveis ​​expressando GFP, e identifica a população de células utilizável para o processamento de downstream. É importante notar que as células mortas da população podem surgir de várias fontes, incluindo a morte de células normais em cultura ou morte celular causada por condições ambientais (por exemplo tripsinização, ou death induzida pelo método de transfecção / transdução escolhido). Aqui mostramos o uso do citômetro de Tali com células U2OS. Métodos semelhantes podem ser realizadas usando a maioria das células de mamíferos e insetos. Para cada linhagem celular, o citômetro de Tali produzidos dados quantitativos GFP expressão, que não é possível com uma inspeção visual das células usando um microscópio padrão de fluorescência. Embora estes resultados são comparáveis ​​aos de citometria de fluxo, são coletados em uma fração do tempo. O citômetro é capaz de precisão células contagem entre 5 mm a 60 m de diâmetro, de preferência em uma concentração de 1 x 10 5 a 1 x 10 7 células / mL. É importante ressaltar que os protocolos de coloração mais uniforme, incluindo o protocolo de coloração Morto Red Cell descritas aqui, use iodeto de propídio para distinguir as células vivas e mortas. Isto representa um desafio ao avaliar a viabilidade das células que foram permeabilizadas para staining de marcadores intracelulares, uma vez que PI vai manchar qualquer célula com uma membrana comprometida. Uma vez que qualquer corante fluorescente ou proteína que pode ser detectada com os canais verde ou vermelho de fluorescência podem ser analisadas no citômetro de Tali Image-Based, estudos futuros podem explorar o uso de corantes alternativos, tais como aminas corantes reativos viabilidade 4. Um estudo de 2006 por Perfetto et al. 12 encontraram estes corantes para ser fácil de usar e reprodutível em discriminar populações de células vivas e mortas. Note que o Tali tem limitações no que diz respeito aos tipos de testes ele pode executar. Por exemplo, já que o objetivo utilizada pelo instrumento é 4X, operações de contagem são limitados a tipos maiores célula: sub-celular das estruturas, tais como mitocôndrias ou vesículas e células bacterianas não podem ser quantificados. Observe também que os canais de detecção em Tali estão limitados a fluoróforos que vão animar e emitem dentro dos canais. Enquanto YFP e brilhante mCherry sinais cum ser detectado, os sinais de dimmer mCherry não pode. Finalmente, a Tali analisa somente as células em suspensão. Ele não vai contar com precisão células aderindo a um slide. Além disso, enquanto há apenas uma capacidade limitada para a contagem de células que estão de forma irregular, incluindo algumas leveduras e células primárias. Além disso, estudos futuros provavelmente vai abordar o uso deste sistema na avaliação da expressão de marcadores intracelulares. Corantes individuais podem ser verificados para sobreposição espectral com canais adjacentes, utilizando a ferramenta da Invitrogen SpectraViewer online ( <a href="http://www.invitrogen.com/spectraviewer">www.invitrogen.com / spectraviewer</a> ). Dada a novidade desta tecnologia, a gama completa de aplicações ainda não foi descoberto. Em resumo, a Tali Citómetro Imagem Baseada demonstrado aqui apresenta uma nova tecnologia que permite a visualização simultânea e análise de populações de células, permitindo a avaliação de células individuais, bem como celpopulações l em um formato compacto, com um fluxo de trabalho simples.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Tali Citómetro Baseado na Imagem </td><td> Invitrogen </td><td> T10796 </td></tr><tr><td> Tali Cellular Slides Análise, 50 Slides </td><td> Invitrogen </td><td> T10794 </td></tr><tr><td> Tali Cellular Slides Análise, 500 slides </td><td> Invitrogen </td><td> T10795 </td></tr><tr><td> Tali Kit de Viabilidade - Red Dead Cell </td><td> Invitrogen </td><td> A10786 </td></tr><tr><td> Tali Kit de Viabilidade - Green Dead Cell </td><td> Invitrogen </td><td> A10787 </td></tr><tr><td> Tali Apoptosis Kit </td><td> Invitrogen </td><td> A10788 </td></tr><tr><td> Células U2OS </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da gfp expressão e viabilidade usando o tali citómetro baseado na imagem

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

De uma única célula e informações da população são comumente obtido por citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência. No entanto, estes dois métodos fornecem informações diferentes. Citometria de fluxo fornece informações multi-paramétricas quantitativas sobre características físicas e coloração ou expressão, mas não permite a visualização. Stand-alone microscopia de fluorescência fornece dados visual, mas não permite simples medições quantitativas 1. Com base em imagens de citometria faz a ponte entre estes dois métodos, permitindo a visualização rápida e análise quantitativa simultânea de milhares de células em populações heterogêneas 2. Aqui, apresentamos um método para a realização de viabilidade celular e ensaios proteína fluorescente verde (GFP) usando a expressão Citómetro Tali Baseado na Imagem 3. O instrumento Tali é um 3-channel (campo claro, fluorescência verde, fluorescência vermelha), plataforma de ensaio de bancada que Offers várias vantagens sobre citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. O citômetro de Tali é menos caro, ocupa menos espaço em banco, requer menos manutenção, e o fluxo de trabalho foi simplificado para que a operação e análise é muito mais simples e mais rápido. O citômetro de Tali é capaz de realizar uma série de suspensão de células baseado em ensaios, incluindo GFP e vermelho proteína fluorescente expressão (RFP), apoptose 4-6 e análise de viabilidade celular com iodeto de propídio (PI) 11/07. Aqui, nós demonstrar o uso do instrumento Tali na realização de um ensaio de viabilidade celular em células expressando GFP. GFP-transduzidas células são coradas utilizando o Kit de Viabilidade Tali - Red Dead Cell. As células são então pipetado em um slide Análise Tali Celular e carregado no citômetro. De campo claro, fluorescência vermelha e verde imagens de fluorescência são capturados e analisados ​​utilizando algoritmos de ensaio específico. Histogramas são então gerados para mostrar o tamanho da célula, PI fluointensidade de fluorescência, e intensidade de fluorescência da GFP. Estes parâmetros podem ser thresholded em casa, em uma população de células específicas. A comparação lado a lado do Citómetro Tali Image-Based e citometria de fluxo tradicional demonstra que os dois métodos fornecem dados comparáveis ​​relativos à viabilidade celular e expressão da proteína. No entanto, o instrumento Tali fornece informações visuais adicionais sobre a população de células que não podem ser obtidos através de um citômetro de fluxo.

Este protocolo descreve como executar a viabilidade celular e ensaios de fluorescência usando a expressão Tali Citómetro Image-Based.

Avaliação da GFP Expressão e Viabilidade Usando o Tali Citómetro Baseado na Imagem

Informações de célula única e de população são comumente obtidas por citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência. No entanto, esses dois métodos fornecem...

Este vídeo demonstra um procedimento para determinar a viabilidade celular em células que expressam GFP utilizando o citômetro baseado em imagem tally. Células transduzidas com GFP são coradas usando o kit de viabilidade tally para células mortas (dead cell red), que cora todas as células mortas de vermelho com iodeto de propídio; as células são transferidas por pipetagem para uma lâmina de análise celular tally e inseridas no citômetro, que adquire e analisa imagens de campo claro e de fluorescência vermelha e verde. Em seguida, são gerados histogramas para exibir a contagem celular, tamanho celular, intensidade de fluorescência de PI e intensidade de fluorescência de GFP, quando comparados à citometria de fluxo tradicional.O Tali pode fornecer dados semelhantes sobre viabilidade celular e expressão. No entanto, essa citometria baseada em imagens fornece informações visuais adicionais sobre a população celular em análise. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência, é que o citômetro baseado em imagens Tali fornece simultaneamente informações quantitativas e visuais sobre sua amostra celular.Além disso, o instrumento de contagem é mais fácil de usar, é menos caro e tem uma pegada menor do que um citômetro de fluxo ou um microscópio de fluorescência. Isso permite que os pesquisadores realizem rapidamente ensaios quantitativos, como viabilidade em células que expressam GFP, diretamente na bancada. Neste procedimento, células U2 OS numa concentração de um vezes 10 à sexta células por mililitro foram transduzidas com um construto viral GFP CellLight com alvo nuclear para manter as células mortas com iodeto de propídio; transfira 100 microlitros da suspensão celular para um novo tubo de microcentrífuga.Observe que uma concentração de um vezes 10 à quinta até um vezes 10 à sétima células por mililitro é recomendada para o ensaio, embora a concentração não precise ser exata. Em seguida, adicione um microlitro do reagente Tally Dead Cell Red. Então, vortexe brevemente para homogeneizar, e incube a mistura de reagente de coloração e células à temperatura ambiente, no escuro, por um a cinco minutos.Após a incubação, prossiga imediatamente para a análise no citômetro baseado em imagem tally. O tally utiliza lâminas descartáveis de plástico projetadas especificamente para o instrumento. Sempre certifique-se de segurar a lâmina pelas bordas ao carregá-la.Pipete 25 microlitros da amostra lentamente em uma das áreas em forma de meia-lua para carregamento de amostras. Aqui, as células controle não transduzidas e não coradas são carregadas na câmara A e as células coradas que expressam GFP são carregadas na câmara B. Para realizar um ensaio de viabilidade em células que expressam GFP, toque em G-F-P-R-F-P na tela inicial do citômetro. As opções do ensaio aparecerão então à direita; selecione GFP mais viabilidade.O instrumento perguntará então se a série de amostras deve ser nomeada para nomear a série de amostras. Pressione nomear agora. Em seguida, utilizando a tela de toque, digite o nome da série de amostras e pressione salvar; o citômetro de contagem avançará automaticamente para a tela de medição.Em seguida, para medir a fluorescência de fundo, pressione a aba de fundo na metade inferior direita da tela de medição, conforme mostrado aqui. A configuração padrão indica que nove campos de células serão imageados. Agora, com a amostra controle voltada para longe do instrumento, insira a lâmina na porta de carregamento até que pare.Não aplique força no toque da tela de fundo para inserir o controle novo de células não coradas. O lâmina será automaticamente puxada para dentro do instrumento e uma imagem em tempo real das células será exibida na tela. Usando o botão de foco, traga as células para o plano de visão adequado enquanto ajusta o foco.Deslize o botão vermelho de zoom para quatro x ou 16 x. Para visualizar melhor a população celular, as células devem apresentar coloração uniformemente escura com um halo brilhante ao redor de cada uma. Conforme mostrado aqui, as células podem ser subestimadas quando a transição entre o fundo e as bordas das células é difusa, de modo que os limites celulares não fiquem bem definidos.As células podem ser superestimadas quando possuem centros brilhantes e periferias escuras. Após colocar as células em foco, toque e pressione para executar o controle de células não coradas. Para medir a fluorescência de fundo, o citômetro capturará automaticamente imagens e exibirá miniaturas de cada campo de visão.A barra de progresso fornece uma atualização contínua da análise. Após a captura da imagem ser concluída, o citômetro ejetará automaticamente a lâmina e fornecerá os dados da análise das imagens capturadas. Os dados armazenados são exibidos no menu suspenso da aba de fundo.A amostra de controle de fundo receberá o mesmo nome atribuído ao experimento. Para executar a amostra transduzida com GFP corada com iodeto de propídio, remova a lâmina do instrumento, gire-a e reinsira-a com a amostra transduzida voltada para longe do instrumento. Pressione a aba da amostra e, em seguida, toque para inserir a nova amostra.Quando a imagem aparecer na tela, use o botão de foco para colocar as células em foco. Como antes, toque para pressionar e executar a amostra. Após a conclusão da captura da imagem, os dados da análise aparecem na guia de amostra e o citômetro ejetará automaticamente a lâmina adequadamente.Descarte o lâmina de análise celular de contagem. Como resíduo biológico perigoso, essas lâminas não podem ser reutilizadas. Após a execução da amostra, os limiares podem ser aplicados à amostra.Para analisar populações celulares específicas aqui, ajustaremos os limiares para determinar a porcentagem de células vivas e mortas. Em células que expressam GFP, na guia amostra, são exibidos o número e a porcentagem de células que expressam GFP, células vivas que expressam GFP, células mortas que expressam GFP, viabilidade total, tamanho médio das células, número de células contadas e concentração celular.Além disso, gráficos de histograma exibindo tamanho celular, fluorescência verde e fluorescência vermelha são mostrados na parte inferior da tela. Para definir o gate de tamanho celular, toque na miniatura de tamanho celular para abrir o histograma de tamanho celular e excluir qualquer debris. Mova as barras deslizantes azuis para excluir eventos grandes e pequenos.Toque para aplicar e incluir as células dentro dos limites. Em seguida, para adicionar a fluorescência GFP à análise, toque na miniatura do histograma de GFP. Para abri-lo.Mova a barra deslizante azul para ajustar o limiar logo à direita do pico mais fraco. Utilize a amostra controle como referência. Isso permite que a análise inclua as células positivas para GFP, mas exclua as células autofluorescentes.A autofluorescência é frequentemente observada quando moléculas biológicas dentro das células são excitadas. Toque para confirmar e retorne à tela anterior. Os dados exibidos na guia amostra devem agora refletir as portas e limiares definidos para ambos os canais de fluorescência. Em seguida, para separar as células coradas com PI da autofluorescência ou de qualquer fundo presente na amostra, pressione a miniatura do histograma de PI para abri-lo novamente.O pico da amostra controle será exibido como um pico cinza no histograma. O pico vermelho é a fluorescência da amostra. A fluorescência de fundo é exibida como o pico mais próximo do valor zero de RFU neste instrumento.Para eliminar a fluorescência de fundo no canal de PI, mova a barra deslizante azul para ajustar o limiar. Para excluir este pico, utilize o pico cinza da amostra controle como referência. Quando o limiar no canal de PI estiver adequadamente definido, toque em aplicar para confirmar e retornar à tela anterior; o instrumento de contagem voltará a analisar automaticamente os dados e atualizará os resultados na guia da amostra.Em seguida, para confirmar visualmente que cada célula foi corretamente atribuída, pressione a aba de zoom e selecione um campo de visão capturado para revisão pressionando a miniatura da imagem. Depois, pressione a aba camadas. Em seguida, pressione o botão GFP ou PI para exibir a imagem capturada por meio desse canal.Pressione o mesmo botão novamente para remover a camada da exibição ou para sobrepor camadas; toque nos botões correspondentes a cada canal para identificar como as células são contadas por um canal específico. Toque nos círculos que envolvem as células contadas apenas pelo canal de campo claro, as quais não expressam fluorescência e serão circuladas em azul. Isso indica que uma célula específica está viva e expressando no canal verde.O GFP será circundado em verde nas células que expressam no canal vermelho. As células coradas com PI serão circundadas em vermelho e são células mortas contadas em ambos. O canal vermelho e o verde serão circundados em amarelo.Isso indica que a célula expressa GFP, mas também está corada com pi e, portanto, está morta. Ocasionalmente, um círculo preto aparecerá na tela. Esses são objetos que foram identificados, mas excluídos da análise com base no tamanho celular.Continue a ajustar finamente o limiar no histograma de fluorescência usando os passos descritos até que cada célula que expressa fluorescência seja circulada com a cor apropriada. Todos os parâmetros de análise são automaticamente salvos no instrumento. Na guia de dados.O aparelho pode armazenar arquivos de dados de 500 execuções de amostras. Cada arquivo armazenado na guia de dados está disponível para reanálise. Ao selecionar o arquivo na guia de dados, ele será reaberto e todos os histogramas e camadas ficarão ativos para arquivar dados e gerar relatórios.Os dados armazenados no instrumento podem ser transferidos para um computador usando uma unidade USB. Quatro tipos representativos de células foram transduzidos com uma construção viral GFP direcionada ao núcleo, marcados com o kit de viabilidade Tally utilizando o reagente Dead Cell Red e analisados no Tally em um citômetro de fluxo, conforme mostrado aqui. Ambos os métodos relataram aproximadamente a mesma porcentagem da população para cada tipo celular que expressava GFP, juntamente com a porcentagem da população total que era viável e expressava GFP.Esses dados demonstram que o citômetro Tali é capaz de discriminar entre a expressão total de GFP em uma população e a expressão de GFP na população de células vivas. Acabamos de demonstrar como utilizar o citômetro baseado em imagens Tali para avaliar a expressão de fluorescência e a viabilidade em sua amostra celular. Esta tecnologia preenche a lacuna entre estudos celulares individuais e populacionais.Utilizando o citômetro baseado em imagem de contagem, é possível coletar informações visuais quantitativas e qualitativas sobre células individuais, bem como sobre populações celulares maiores. Utilizando o mesmo procedimento, diversos outros ensaios podem ser realizados, incluindo apoptose, expressão de RFP e viabilidade celular. Para células não expressoras, as aplicações potenciais incluem a avaliação da expressão gênica até estudos sobre a eficácia de fármacos.

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