Avaliação da GFP Expressão e Viabilidade Usando o Tali Citómetro Baseado na Imagem

Este vídeo demonstra um procedimento para determinar a viabilidade celular em células que expressam GFP usando o citômetro baseado em imagem de sinalização. As células transduzidas por GFP são coradas usando o kit de viabilidade de contagem de células mortas vermelhas, que cora todas as células mortas de vermelho com iodeto de propídio, as células são pipetadas em uma lâmina de análise celular de contagem e carregadas no citômetro, que adquire e analisa imagens de campo claro e fluorescência vermelha e verde. Os histogramas são então gerados para exibir a contagem de células, a intensidade de fluorescência PI do tamanho da célula e a intensidade de fluorescência GFP quando comparados à citometria de fluxo tradicional.

Tali pode fornecer dados semelhantes sobre a viabilidade e expressão celular. No entanto, esta citometria baseada em imagem fornece informações visuais adicionais sobre a população de células que está sendo examinada. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência, é que o citômetro baseado em imagem de contagem fornece informações quantitativas e visuais simultaneamente sobre sua amostra de célula.

Além disso, o instrumento de contagem é mais fácil de usar, é mais barato e ocupa menos espaço do que um citômetro de fluxo ou um microscópio de fluorescência. Isso permite que os pesquisadores realizem rapidamente ensaios quantitativos como viabilidade em células que expressam GFP na bancada. Neste procedimento, as células U2 OS em uma concentração de uma vez 10 elevado a seis células por mililitro foram transduzidas com a construção viral GFP de luz celular direcionada nuclear para sustentar as células mortas com iodeto de propídio transferindo 100 microlitros da suspensão celular para um novo tubo de microcentrífuga.

Observe que uma concentração de um vezes 10 elevado a um a um vezes 10 elevado a sétimo células por mililitro é recomendada para o ensaio, embora a concentração não precise ser exata. Em seguida, adicione um microlitro de reagente vermelho de células mortas registrado. Em seguida, faça um vórtice breve para misturar, incube o reagente de coloração e a mistura de células à temperatura ambiente no escuro por um a cinco minutos.

Após a incubação, proceder imediatamente à análise no citómetro de imagem de sinalização. A contagem usa lâminas de análise celular de plástico descartáveis projetadas especificamente para o instrumento. Certifique-se sempre de segurar o slide pelas bordas para carregá-lo.

Pipete 25 microlitros de amostra lentamente em uma das áreas de carregamento de amostras em forma de meia-lua. Aqui, as células de controle não transduzidas não coradas são carregadas na câmara A e as células que expressam GFP coradas são carregadas na câmara B.To realizar um ensaio de viabilidade em células que expressam GFP, toque em GFP na tela inicial do citômetro. As opções de ensaio aparecerão à direita, selecione GFP mais viabilidade.

O instrumento perguntará então se a série de amostras deve ser nomeada para nomear a série de amostras. Pressione o nome agora. Em seguida, usando a tela sensível ao toque, digite o nome da série de amostras e pressione salvar, o citômetro de contagem avançará automaticamente para a tela de medição.

Em seguida, para medir a fluorescência de fundo, pressione a guia de fundo na metade inferior direita da tela de medição, como pode ser visto aqui. A configuração padrão indica que nove campos de células serão criados. Agora, com a amostra de controle voltada para longe do instrumento, insira a corrediça na porta de carregamento até que ela pare.

Não aplique força na tela de fundo, pressione por toque para inserir um novo controle de célula não corado. O slide será puxado automaticamente para dentro do instrumento e uma imagem ao vivo das células será exibida na tela. Usando o botão de foco, coloque as células no plano de visão adequado enquanto foca.

Deslize o botão vermelho de zoom para quatro x ou 16 x. Para visualizar melhor a população de células, as células devem ser uniformemente escuras com um halo brilhante ao redor de cada uma. Como mostrado aqui, as células podem ser subestimadas quando a transição entre o plano de fundo e as bordas das células é difusa, de modo que os limites das células não são bem definidos.

As células podem ser contadas em excesso quando têm centros claros e perímetros escuros. Depois que as células forem focadas, toque e pressione para executar o controle de células não coradas. Para medir a fluorescência de fundo, o citômetro capturará automaticamente as imagens e exibirá miniaturas de cada campo de visão.

A barra de progresso fornece uma atualização contínua da análise. Após a conclusão da captura da imagem, o citômetro ejeta automaticamente a lâmina e fornece os dados da análise das imagens capturadas. Os dados armazenados são exibidos no menu suspenso da guia de plano de fundo.

A amostra de controle de fundo receberá o mesmo nome dado ao experimento. Para executar a amostra transduzida GFP corada com PI, remova a lâmina do instrumento, vire-a e insira-a novamente com a amostra transduzida voltada para longe do instrumento. Pressione a guia de amostra e, em seguida, toque em pressionar para inserir uma nova amostra.

Quando a imagem aparecer na tela, use o botão de foco para colocar as células em foco. Como antes, toque em pressionar para executar a amostra. Após a conclusão da captura da imagem, os dados da análise aparecem na guia de amostra e o citômetro ejeta automaticamente a lâmina adequadamente.

Descarte a lâmina de análise celular de contagem. Como resíduos de risco biológico, essas lâminas não podem ser reutilizadas. Depois que a amostra é executada, os limites podem ser aplicados à amostra.

Para analisar populações de células específicas aqui, ajustaremos os limites para determinar a porcentagem de células vivas e mortas. Nas células que expressam GFP na guia amostra, o número e a porcentagem de células que expressam GFP células vivas e mortas que expressam GFP são totalmente viáveis. O tamanho médio da célula, o número de células contadas e a concentração da célula são exibidos.

Além disso, gráficos de histograma exibindo o tamanho da célula, fluorescência verde e fluorescência vermelha são exibidos na parte inferior da tela. Para definir a porta de tamanho da célula, toque na miniatura do tamanho da célula para abrir o histograma do tamanho da célula para excluir quaisquer detritos. Mova as barras deslizantes azuis para excluir eventos grandes e pequenos.

Toque em aplicar para incluir as células dentro dos portões. Em seguida, para adicionar a fluorescência GFP à análise, toque na miniatura do histograma GFP. Para abri-lo.

Mova a barra deslizante azul para definir o limite à direita do pico mais escuro. Use a amostra de controle como guia. Isso permite que a análise inclua as células GFP positivas, mas exclua as células autofluorescentes.

A autofluorescência é freqüentemente observada quando moléculas biológicas dentro das células são aplicadas para confirmar e retornar à tela anterior. Os dados exibidos na guia de amostra agora devem refletir as portas e o limite definidos para ambos os canais de fluorescência. Em seguida, para separar as células de coloração PI da autofluorescência ou de qualquer fundo presente na amostra, pressione a miniatura do histograma PI para abri-la novamente.

O pico da amostra de controle será exibido como um pico cinza no histograma. O pico vermelho é a fluorescência da amostra. A fluorescência de fundo é exibida como um pico mais próximo do valor RFU zero neste instrumento.

Para eliminar a fluorescência de fundo no canal PI, mova a barra deslizante azul para ajustar o limite. Para excluir esse pico, use o pico cinza da amostra de controle como referência. Quando o limite no canal PI estiver definido adequadamente, toque em aplicar para confirmar e retornar à tela anterior, o instrumento de contagem reanalisará automaticamente os dados e atualizará os resultados na guia de amostra.

Em seguida, para confirmar visualmente se cada célula está atribuída corretamente, pressione a guia de zoom e selecione um campo de visão capturado para revisão pressionando a miniatura da imagem. Em seguida, pressione a guia de camadas. Em seguida, pressione o botão GFP ou PI para exibir a imagem capturada por esse canal.

Pressione o mesmo botão novamente para remover a camada da tela ou para sobrepor camadas, toque nos botões correspondentes a cada canal para identificar como as células são contadas em um canal específico. Círculos de toque As células que foram contadas apenas pelo canal de campo claro, que não expressam fluorescência, serão circuladas em azul. Isso indica que uma célula específica é de células vivas expressando no canal verde.

A GFP será circulada em células verdes expressando-se no canal vermelho. Manchado com pi será circulado em vermelho e são células mortas contadas em ambos. O canal vermelho e verde será circulado em amarelo.

Isso indica que a célula expressa GFP, mas também está corada com pi e, portanto, está morta. Ocasionalmente, um círculo preto aparecerá na tela. Esses são objetos que foram identificados, mas foram excluídos da análise com base no tamanho da célula.

Continue a ajustar o limite no histograma de fluorescência usando as etapas descritas até que cada célula que está expressando fluorescência seja circulada com a cor apropriada. Todos os parâmetros de análise são salvos automaticamente no instrumento. Abaixo do toque de dados.

A contagem pode armazenar arquivos de dados de 500 execuções de amostra. Cada arquivo armazenado na guia de dados está disponível para reanálise. Ao selecionar o arquivo na guia de dados, ele será reaberto e todos os histogramas e camadas se tornarão ativos para arquivar dados e gerar relatórios.

Os dados armazenados no instrumento podem ser transferidos para um computador usando uma unidade USB. Quatro tipos de células representativas foram transduzidos com uma luz celular alvo nuclear, construção viral GFP corada com kit de viabilidade de contagem usando reagente vermelho de células mortas e analisada pela contagem em um citômetro de fluxo, conforme mostrado aqui. Ambos os métodos relataram aproximadamente a mesma porcentagem da população para cada tipo de célula que expressava GFP, juntamente com a porcentagem da população total que era viável e expressava GFP.

Esses dados demonstram que o citômetro Tali é capaz de discriminar entre a expressão total de GFP em uma população e a expressão de GFP na população viva. Acabamos de demonstrar como usar o citômetro baseado em imagem de contagem para avaliar a expressão e a viabilidade da fluorescência em sua amostra de células. Essa tecnologia preenche a lacuna entre estudos de células individuais e populacionais.

Usando o citômetro baseado em imagem de contagem, você pode coletar informações visuais quantitativas e qualitativas sobre células individuais, bem como populações de células maiores. Usando o mesmo procedimento, vários outros ensaios podem ser realizados, incluindo apoptose, expressão de RFP e viabilidade celular Para células não expressantes, as aplicações potenciais incluem avaliação da expressão gênica para estudos de eficácia de medicamentos.