Name: Um sistema de expressão dupla baseado em complementação GFP para avaliar o contato célula-célula mediado por citonemas em discos imaginais de asas de Drosophila vivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprenda a visualizar contatos célula-célula em discos imaginais de asas de Drosophila usando complementação GFP. Este método permite estudar citonemas em tecidos vivos e investigar a comunicação celular no controle do crescimento tecidual.

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O driver nubbin-GAL4 é usado para expressar CD4-spGFP1-10 especificamente na região da bolsa da asa do DP ( Figura 1A ). O driver PerM-LexA21 é usado para expressar CD4-spGFP11 especificamente no PerM (Figura 1A). Esses dois sistemas de expressão são independentes um do outro, permitindo a expressão simultânea e específica de diferentes transgenes em DP e PerM (Figura 1B,C).
O esquema genético básico envolve o cruzamento de moscas para gerar larvas do genótipo nub-GAL4 / UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. Como controle negativo, deixamos de fora o transgene LexAop-CD4-spGFP11 . Outros transgenes (por exemplo, RNA de fita dupla codificador de proteínas) podem ser expressos conforme desejado na camada DP (sob o controle de sequências UAS ) ou no PerM (sob o controle do operador LexA).
Este é um protocolo de imagem ao vivo que não pode ser interrompido. A preparação do material é estimada em ~10 min. As dissecções não devem ser realizadas por mais de 20 minutos de cada vez antes da aquisição de imagens. A imagem leva ~ 30 min e não deve durar mais de ~ 1 h. Para várias condições ou um grande número de amostras, o procedimento deve ser realizado em várias rodadas para garantir os melhores resultados.
1. Preparação do material
<ol>
	<li>Antes da dissecação, limpe uma pinça, uma placa de depressão de vidro de 9 poços (ou outro recipiente adequado para coletar e limpar larvas) e uma placa de Petri reutilizável revestida de Sylgard (silicone) usada para dissecação com etanol a 70%.</li>
	<li>Prepare as lâminas do microscópio realizando uma lavagem com etanol a 70% e, em seguida, colando um espaçador de imagem na lâmina seca. Corte os poços individuais da tira de 8 poços com uma tesoura e corte ao meio (Figura 2A). Remova o suporte protetor de um lado de cada metade e cole espaçadores na lâmina, ligeiramente espaçados para criar um espaço protegido no meio onde os discos serão colocados (Figura 2B). NOTA: Em nossa experiência, isso simplifica a montagem da amostra, pois o volume preciso do meio transferido para a lâmina é menos crítico. Qualquer pequeno excesso de volume simplesmente fluirá pela abertura após a aplicação da lamínula. Como imageamos por apenas um tempo relativamente curto (geralmente ~ 1 h), não tivemos problemas com a secagem média.</li>
	<li>Descongele o meio de imagem ao vivo (meio Drosophila de Schneider não suplementado armazenado em alíquotas congeladas de 10 mL) e mantenha-o prontamente acessível em um balde de gelo.</li>
	<li>Em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, misture 1,5 mL de meio com 20 μL de 200 μg / mL Hoechst 33342 (concentração final de 2,7 μg / mL). Mantenha o tubo no gelo. NOTA: Esta forma específica de corante Hoechst é usada porque é altamente permeável à membrana. CUIDADO: Luvas devem ser usadas ao manusear Hoechst 33342. As ferramentas devem ser lavadas após o uso.</li>
</ol>
2. Dissecção do disco da asa e preparação da corrediça
<ol>
	<li>Após o cruzamento genético e a criação a 25 ° C, pegue as larvas errantes de terceiro ínstar do tubo e lave-as em meio frio de imagem viva em uma placa de depressão de vidro de 9 poços. NOTA: Os citonemas são muito frágeis. Nos passos seguintes, deve-se ter o cuidado de manipular os tecidos ao redor dos discos, tentando evitar o contato direto entre os discos e as ferramentas de dissecção. Preparamos três ou quatro larvas de cada vez, pois é inevitável danificar alguns discos, e isso só pode se tornar perceptível durante as etapas de imagem.</li>
	<li>Sob o microscópio de dissecação, transfira as larvas para uma gota de meio de imagem ao vivo em uma placa de Petri revestida de silicone e comece a dissecar usando duas pinças de dissecação. Para fazer isso, primeiro segure a cabeça e a parte anterior do corpo com firmeza, beliscando as larvas com um par de pinças a cerca de um terço do comprimento do corpo (do anterior). Usando o segundo par de pinças, aperte o corpo logo posterior à primeira pinça. Em seguida, puxe a parte posterior das larvas para isolar a "metade" anterior.</li>
	<li>Inverta a metade anterior prendendo-a com uma pinça de cada lado da extremidade cortada e empurrando a cabeça com o outro par (como virar uma meia do avesso), para expor as estruturas internas, incluindo discos imaginários, traqueia, glândulas salivares, corpo gorduroso e intestino.</li>
	<li>Remova cuidadosamente as glândulas salivares, o corpo gorduroso e o intestino, tomando cuidado para não perturbar os troncos laterais da traqueia, que devem revestir e proteger os discos das asas.</li>
	<li>Use uma pinça para transferir cuidadosamente as metades anteriores limpas com discos de asa anexados para uma gota de meio de imagem ao vivo limpo com Hoechst, colocado entre os espaçadores em uma lâmina preparada (Figura 2C). Isole os discos das asas do resto dos tecidos, dissecando-os suavemente para longe dos ramos finos da traqueia que se conectam ao disco, usando uma lâmina da pinça de dissecação ou um fio fino de tungstênio preso a um porta-agulha de dissecação. Descarte o resto da carcaça.</li>
	<li>Oriente os discos usando uma lâmina da pinça de dissecação ou agulha de dissecação de fio de tungstênio. Devido à sua forma achatada em forma de lágrima, os discos das asas cairão com o DP ou o PerM voltados para cima. Para este protocolo, oriente todos os discos com o lado PerM para cima.</li>
	<li>Ajuste o volume do meio para preencher o poço inteiramente, um pouco acima do nível do espaçador de imagem, adicionando ou removendo o meio conforme necessário. Remova o suporte protetor da parte superior de cada metade do espaçador de imagem e, em seguida, abaixe cuidadosamente uma lamínula sobre a amostra. Pressione suavemente a lamínula onde ela entra em contato com os espaçadores de imagem (por exemplo, com a extremidade arredondada da pinça de dissecação) para garantir que a lamínula adira ao espaçador. NOTA: O nível médio deve estar ligeiramente acima da altura do espaçador para evitar a retenção de bolhas de ar, mas não tão alto a ponto de gerar um fluxo significativo quando a lamínula for abaixada.</li>
</ol>
3. Exames de imagem
<ol>
	<li>Amostras de imagens à temperatura ambiente usando um microscópio confocal (laser de íons argônio com comprimento de onda de 488 nm para GFP, laser UV com comprimento de onda de 350 nm para Hoechst) equipado com uma lente de imersão em óleo de 40x/1,30 NA e software de microscopia. Adquira pilhas de imagens com tamanho de passo de 1 μm que vão desde logo acima do nível mais alto do PerM (onde a fluorescência de Hoechst diminui) até o lado basal do DP, o que geralmente resulta em mais de 100 imagens por pilha. Adquira pilhas de imagens repetidas para gerar filmes timelapse. NOTA: Criamos uma imagem de um slide por não mais do que ~ 1-2 h.</li>
	<li>Para as configurações do software do microscópio, adquira imagens usando codificação de 8 bits, média de linha de 2, ganho do detector geralmente entre 650 e 750 e faixas de canal separadas para reduzir o sangramento do sinal. Use configurações idênticas de laser e detector para todas as condições, predeterminadas pela realização de testes em cada condição com antecedência. NOTA: Com ampliação de 40x, nossas imagens têm uma resolução de 5,0386 pixels por μm (tamanho do pixel: 0,1985 x 0,1985 μm2). Em nossa configuração, as configurações ideais do microscópio confocal incluíam a maior intensidade de laser possível (sem danificar o tecido) para capturar o máximo de sinal possível, ao mesmo tempo em que produziam pouca ou nenhuma saturação; e o menor ruído possível, conforme avaliado em controles negativos, obtido pela redução do deslocamento do detector e da velocidade de aquisição (se necessário). Geralmente usamos menos de 5% da potência do laser e da velocidade máxima do cabeçote de varredura ('9' nas configurações do software Zen). Uma única pilha de imagens normalmente leva ~ 1 min 45 s para ser adquirida, e as imagens são tiradas a cada 2-3 min para análises de lapso de tempo.</li>
</ol>
4. Análise de imagem
<ol>
	<li>Pilhas de projetos usando a função de projeção de intensidade máxima do pacote de software ImageJ (clique na imagem | Pilhas | Z, selecione Intensidade máxima no menu).</li>
	<li>Nas imagens MIP, determine a área da bolsa da asa com base no padrão de dobramento do disco da asa (usando o canal Hoechst) usando a seleção de polígonos. Use a mesma seleção no canal GFP com a função Clear Outside ( clique em Edit | Limpar fora) para definir cada valor de pixel externo como 0.</li>
	<li>Nas imagens MIP, use o canal Hoechst para limpar as imagens GFP, removendo especificamente quaisquer pontos artefactuais que apareçam em ambos os canais, definindo o valor de pixel em questão como 0 (clique em Seleção de polígono e, em seguida, Editar | limpar).</li>
	<li>Nas imagens MIP limpas, use a função Histograma (clique em Analisar | Histograma | List) para obter e copiar a lista de todos os valores de pixel em uma tabela em uma planilha.</li>
	<li>Defina um valor limite com base na análise do sinal de fundo em controles negativos (e depois verificado em outras amostras; veja a discussão).</li>
	<li>Calcule a porcentagem de superfície positiva para GFP usando a seguinte fórmula: % GFP-superfície positiva = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68411/68411eq01.jpg" style="margin: auto;"> × 100</li>
	<li>Normalize os dados no final dividindo cada valor pela média da condição de referência (que é definida como 1). NOTA: Pixel válido = pixel com um valor ≥ 1, ignorando efetivamente qualquer pixel excluído cujo valor foi definido como 0. Valores de pixel de 0 não ocorrem naturalmente.</li>
	<li>Para determinar onde nos discos o sinal GFP reconstituído se localiza, use refatias XZ de pilhas de imagens para observar o eixo apicobasal do epitélio do disco. Execute as refatias em Fiji sem interpolação e aumente a altura da imagem no eixo Z usando a função Escala com interpolação bilinear para melhorar a visibilidade.</li>
</ol>

<ol><li>Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+basis+of+pattern+formation+during+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development.</a> Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).</li>
<li>Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+and+the+dispersion+of+morphogens%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytonemes and the dispersion of morphogens.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (6), 445-463 (2014).</li>
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<li>Hatori, R., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+produced+by+the+Drosophila+wing+imaginal+disc+induces+distinct+responses+in+three+target+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog produced by the Drosophila wing imaginal disc induces distinct responses in three target tissues.</a> Development. 147 (22), dev195974(2020).</li>
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<li>Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+interactions+between+squamous+and+columnar+epithelia+of+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling interactions between squamous and columnar epithelia of the Drosophila wing disc.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3363-3370 (2005).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Microscópio de dissecção Discovery V12</td><td>Zeiss</td><td></td><td>microscópio de dissecção</td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #55, dicas de biologia</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11255-20</td><td>pinça de dissecação</td></tr><tr><td>EP-Slik (slik20358)</td><td>BDSC</td><td>Panneton et al. 2015&nbsp;</td><td>estirpe de mosca para expressar Slik</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td>Schindelin J. et al. (2012)&nbsp;</td><td>software de análise de imagens</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H3570&nbsp;</td><td>coloração nuclear de imagem ao vivo&nbsp;</td></tr><tr><td>LexAop-CD4-spGFP11&nbsp; </td><td>BDSC</td><td>93018</td><td>Linhagem de mosca</td></tr><tr><td>Microscópio confocal LSM 700</td><td>Zeiss</td><td></td><td>microscópio confocal</td></tr><tr><td>nub-GAL4</td><td>Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington (BDSC)</td><td>86108</td><td>Linhagem de mosca</td></tr><tr><td>PerM-LexA</td><td></td><td>Rambaud, Joseph et al., 2025</td><td>Linhagem de mosca</td></tr><tr><td>Placa de spot de vidro PYREX de 9 depressõesvender</td><td>Ciências da Vida da Corning</td><td>7220-85</td><td>para coletar e lavar larvas</td></tr><tr><td>Drosophila de Schneider Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21720024</td><td>meio de imagem ao vivo</td></tr><tr><td>Espaçadores de imagem SecureSeal, 8 poços, 0,12 mm de espessura&nbsp;</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>Espaçador</td></tr><tr><td>Kit de elastômero de silicone SYLGARD 184</td><td>Silgard</td><td>3097358-1004</td><td>para fazer placas de dissecação</td></tr><tr><td>UAS-CD4-spGFP1-10&nbsp; </td><td>BDSC</td><td>93017</td><td>Linhagem de mosca</td></tr><tr><td>Preto Zen</td><td>Zeiss</td><td></td><td>software de aquisição</td></tr></tbody></table>

um sistema de expressão dupla baseado em complementação gfp para avaliar o contato célula-célula mediado por citonemas em discos imaginais de asas de drosophila vivas

A GFP Complementation-based Dual-expression System for Assessing Cell-Cell Contact Mediated by Cytonemes in Live Drosophila Wing Imaginal Discs

Para testar a utilidade do procedimento GRASP para medir contatos entre células DP e PerM, examinamos discos de asa de quatro genótipos diferentes: discos de controle negativo do tipo selvagem (genótipo: w1118) que exibirão apenas níveis de fundo de autofluorescência no canal GFP; discos expressando o CD4-spGFP1-10 na camada DP, mas sem o transgene CD4-spGFP11, que mostrará o nível de fluorescência produzido apenas por GFP1-10 (que esperávamos ser insignificante, já que GFP1-10 não deve fluorescer<sup...

Um sistema de expressão dupla baseado em complementação GFP para avaliar o contato célula-célula mediado por citonemas em discos imaginais de asas de Drosophila vivas

Embryonic tissue growth and patterning are largely controlled by signals exchanged locally between cell populations within the tissues themselves. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Aqui nós descrevemos um protocolo para analisar a migração de células gliais no olho Drosophila desenvolvimento, utilizando análise microscópica ao vivo emparelhado com GFP tag células gliais.

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

O cinetocoro é onde o SAC inicia seu sinal de monitoramento da segregação mitótica das cromátides irmãs. Um método é descrito para visualizar o recrutamento e de rotação de uma das proteínas cinetocoro e pela sua coordenação com o movimento cromossoma...

Estudar checkpoint mitótico por Ilustrando comportamento dinâmico cinetocoro Proteína e Movimento de cromossomos em Viver<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões Sincicial

Este vídeo demonstra a coloração por imunofluorescência de um cérebro transgênico de Drosophila para imagens de células gliais de células únicas. O cérebro expressa proteínas direcionadas à membrana fundidas com diferentes combinações de epítopos antigênicos sob o controle de um sistema de recombinase específico da glia. Os cérebros isolados e fixados são corados com anticorpos primários específicos para os epítopos antigênicos, seguidos por anticorpos secundários conjugados com fluoróforo.

Coloração por imunofluorescência de cérebros de Drosophila para a imagem de célula única de células gliais

Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

As estruturas adultas de Drosophila são derivadas de estruturas semelhantes a sacos chamadas discos imaginais. A análise desses discos fornece informações sobre muitos processos de desenvolvimento, incluindo determinação de tecidos, estabelecimento de limites de compartimentos, proliferação celular, especificação do destino celular e polaridade celular planar. Este protocolo é usado para preparar discos imaginais para microscopia de luz / fluorescente.

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de Drosophila melanogaster

Este protocolo apresenta um método eficiente para obter imagens do neuroepitélio do olho pupal de Drosophila vivo. Este método compensa o movimento do tecido e a topologia irregular, melhora a visualização dos limites celulares por meio do uso de várias proteínas de junção marcadas com GFP e usa um equipamento de imagem facilmente montado.

Vivo-imaging da Drosophila Pupal Eye

Células exibir diferentes morfologias e estabelecer uma variedade de interações com seus vizinhos. Este protocolo descreve como para revelar a morfologia das células únicas e para investigar a interação célula-célula, usando o sistema de expressão Gal4/UAS bem estabelecido.

Aplicação de técnica de FlpOut MultiColor para estudar a alta resolução única célula morfologias e interações de células da Glia em Drosophila

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para realizar imagens ao vivo da divisão assimétrica de células-tronco germinativas (GSCs) no nicho ovariano de Drosophila. Usamos uma linhagem transgênica que expressa de forma ubíqua uma fusão de proteína fluorescente verde (GFP) da proteína do espectrossomo Par-1.

Imagem ao vivo estendida de nichos de células-tronco germinativas de Drosophila melanogaster fêmea

A hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão (EASI-FISH) é uma técnica robusta que combina microscopia de expansão com hibridização in situ de fluorescência (FISH) para detectar a expressão de vários genes em tecidos espessos. Este protocolo descreve os recentes avanços no método e sua adaptação para rotular o sistema nervoso central intacto da Drosophila.

Detecção multiplex da expressão gênica no cérebro intacto de Drosophila usando hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão

Este artigo descreve um protocolo eficiente de dissecação imaginária de discos e coloração de anticorpos, econômico com reagentes e facilita o manuseio de discos imaginários em pequenas quantidades.

Dissecação em pequena escala e coloração por anticorpos de discos imaginários antenas oculares e das asas de Drosophila melanogaster

Aprenda a visualizar contatos célula-célula em discos imaginais de asas de Drosophila usando complementação GFP. Este método permite estudar citonemas em tecidos vivos e investigar a comunicação celular no controle do crescimento tecidual.

Um sistema de expressão dupla baseado em complementação GFP para avaliar o contato célula-célula mediado por citonemas em discos imaginais de asas de Drosophila vivas (Vídeo) | JoVE Journal

Um sistema de expressão dupla baseado em complementação GFP para avaliar o contato célula-célula mediado por citonemas em discos imaginais de asas de Drosophila vivas

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