Um sistema de expressão dupla baseado em complementação GFP para avaliar o contato célula-célula mediado por citonemas em discos imaginais de asas de Drosophila vivas

Portanto, nossa pesquisa se concentra em entender como as células localizadas distantes nos tecidos se comunicam umas com as outras. Estamos usando o disco imaginário da asa de Drosophila como um sistema modelo para tentar entender como a citidina é formada, como funciona e qual o papel que desempenha no controle local do crescimento do tecido. Estudos sugerem que os fatores de crescimento estão frequentemente viajando através de projeções celulares especializadas, como filopódios de sinalização baseados em actina, chamados citonemas, para serem entregues às células-alvo.

Os citonemas são estruturas muito finas e frágeis que são facilmente interrompidas pelo protocolo de fixação. Para observá-los, você precisa usar abordagens de imagem ao vivo dedicadas com proteína marcada com fluorescência expressa. Isso limita muito a ferramenta e as abordagens que podemos usar para investigá-los.

Identificamos uma proteína quinase chamada Slik que está envolvida na biogênese do citonemo. A expressão de Slik em uma camada epidural no disco imaginal da asa desencadeia a formação de citonema que atravessa o lúmen do disco e estimula a proliferação de células na camada epitelial vizinha. No futuro, gostaríamos de identificar a proteína que atua a jusante de Slik para promover a formação de citonemas, identificar o ligante que é entregue por meio desse citonemo para promover a perfuração e entender melhor a importância fisiológica desse mecanismo no controle do crescimento tecidual.

Para começar, corte poços individuais da tira de oito poços usando uma tesoura e, em seguida, corte cada poço ao meio. Remova o suporte protetor de um lado de cada metade e cole os espaçadores na lâmina do microscópio, espaçando-os ligeiramente para criar um espaço central protegido para a colocação do disco. Escolha larvas de terceiro ínstar errantes do tubo de criação após cruzamento genético e incubação a 25 graus Celsius.

Sob um microscópio de dissecação, transfira as larvas para uma gota de meio de imagem vivo em uma placa de Petri revestida de silicone. Usando duas pinças de dissecação, inicie a dissecção beliscando as larvas a cerca de 1/3 do comprimento do corpo anterior com um par de pinças para mantê-las firmes. Com o segundo par, aperte o corpo logo posterior ao primeiro ponto e puxe para separar a metade posterior, isolando a seção anterior.

Inverta a metade anterior segurando os dois lados da extremidade cortada com uma pinça e empurrando a cabeça usando um segundo par, virando-a do avesso. Isso expõe estruturas internas, como discos imaginários, traqueia, glândulas salivares, corpo gorduroso e intestino. Remova as glândulas salivares, o corpo adiposo e o intestino usando uma pinça, tomando cuidado para não perturbar os troncos traqueais laterais que recobrem os discos das asas.

Usando uma pinça, transfira as metades anteriores limpas com discos de asa anexados para uma gota de meio de imagem ao vivo limpo com ganchos colocados entre os espaçadores de lâmina. Para isolar os discos das asas, disseque-os suavemente dos ramos finos da traqueia com uma lâmina da pinça de dissecação ou um fio fino de tungstênio montado em um porta-agulha de dissecação. Descarte a carcaça restante.

Oriente os discos das asas usando uma lâmina de pinça de dissecação ou agulha de tungstênio para que o lado da membrana peripodial fique voltado para cima. Ajuste o volume médio para que ele encha um pouco o poço acima do nível do espaçador. Remova o suporte protetor superior do espaçador de imagem e abaixe suavemente uma lamínula sobre a amostra.

Pressione a lamínula nos pontos de contato do espaçador usando a extremidade arredondada da pinça para garantir a adesão adequada. Para projetar as pilhas de imagens no ImageJ, selecione Imagem, depois Pilhas, seguido por Projeto Z e escolha Intensidade máxima no menu. Nas imagens de projeção de intensidade máxima, identifique a área da bolsa da asa com base no padrão de dobra do disco da asa usando o canal dos ganchos e a ferramenta de seleção de polígonos.

Aplique a mesma seleção ao canal GFP e selecione Editar seguido de Limpar fora para eliminar o ruído fora da região selecionada. Use o canal de ganchos nas imagens de projeção de intensidade máxima para identificar os pontos artefactuais nas imagens GFP. Em seguida, selecione a área usando a ferramenta de seleção de polígonos.

Clique em Editar e escolha Limpar. Nas imagens de projeção de intensidade máxima limpas, selecione Analisar, seguido de Histograma e escolha Listar para obter todos os valores de pixel. Copie essa lista em uma tabela de planilha.

Para definir um valor limite, analise o sinal de fundo nas amostras de controle negativo e confirme esse valor usando outras imagens de amostra. Calcule a porcentagem de superfície positiva para GFP dividindo o número de pixels acima do limite pelo número total de pixels válidos e multiplicando o resultado por 100. Por fim, normalize cada valor calculado depois de dividi-lo pela média da condição de referência, que é definida como um.

Em discos do tipo selvagem sem ambos os componentes GFP divididos, apenas uma autofluorescência granular mínima de GFP foi observada perto do centro da bolsa da asa, e esse sinal de linha de base foi usado para definir um limite de fluorescência. Os discos que expressam apenas GFP1-10 dividido em CD4 na camada adequada do disco mostraram níveis de fluorescência indistinguíveis do tipo selvagem, confirmando a natureza não fluorescente do GFP1-10 sozinho. A co-expressão de GFP1-10 dividida em CD4 no disco propriamente dito e CD4spGFP11 na membrana peripodial levou a um aumento notável em pontos GFP discretos e brilhantes localizados no lúmen do disco, com uma área positiva de fluorescência significativamente maior acima do limiar do que os controles.

A expressão de Slik no disco propriamente dito causou um forte aumento na densidade dos núcleos da membrana peripodial e um aumento dramático na intensidade do sinal GFP na região da bolsa da asa, sugerindo que os citonemas induzidos por Slik estabelecem contato aprimorado com as células da membrana peripodial.